Die Proteinreinigung kann durch verschiedene Methoden erreicht werden, die jeweils unterschiedliche Eigenschaften von Proteinen ausnutzen. Hier sind fünf gängige Methoden:

1. Affinitätschromatographie
   Nutzt spezifische Wechselwirkungen zwischen dem interessierenden Protein und einem an eine Chromatographieharz gebundenen Liganden. His-markierte Proteine binden an Ni-NTA-Harz, Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen. Die Vorteile dieser Methode sind hohe Spezifität und Ausbeute, oft mit hoher Reinheit.

2. Ionenaustauschchromatographie
   Trennt Proteine basierend auf ihrer Ladung. Proteine binden an geladenes Harz und werden durch Änderung der Salzkonzentration oder des pH-Werts eluziert. Beispiele sind DEAE (Anionenaustauscher) und CM (Kationenaustauscher) Harze. Die Vorteile dieser Methode liegen darin, dass sie gut zur Trennung von Proteinen mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten (pI) geeignet ist.

3. Größenausschlusschromatographie (Gel-Filtration)
   Trennt Proteine basierend auf ihrer Größe. Größere Proteine eluieren zuerst, da sie nicht in die Poren des Harzes eintreten, während kleinere Proteine später eluieren. Beispiele sind Sephadex, Superdex und Bio-Gel Harze. Diese Methode ist nützlich zum Entsalzen und Pufferwechsel sowie zur Bestimmung des Molekulargewichts.

4. Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)
   Trennt Proteine basierend auf ihrer Hydrophobizität. Proteine binden in hohen Salzkonzentrationen an hydrophobes Harz und werden durch Verringerung der Salzkonzentration eluziert. Beispiele sind Phenyl-Sepharose und Octyl-Sepharose Harze. Diese Methode ist effektiv zur Trennung von Proteinen mit unterschiedlichen Hydrophobizitätsgraden.

5. Elektrophorese
   Trennt Proteine basierend auf ihrer Größe und Ladung durch Anlegen eines elektrischen Feldes. SDS-PAGE wird häufig verwendet, um Proteine basierend auf ihrem Molekulargewicht zu trennen. Beispiele sind SDS-PAGE (denaturierend), Native PAGE (nicht denaturierend) und IEF (isoelektrische Fokussierung). Diese Methode bietet eine hohe Auflösung und wird weitgehend für analytische Zwecke verwendet, um die Reinheit und das Molekulargewicht zu beurteilen.

Jede dieser Methoden kann einzeln oder in Kombination verwendet werden, um den gewünschten Reinheitsgrad und die Ausbeute für das Zielprotein zu erreichen.

EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) wird aus mehreren Gründen häufig bei der Proteinreinigung verwendet:

• Chelatbildner: EDTA ist ein starkes Chelatbildner, das sich an Metallionen wie Calcium, Magnesium und Eisen bindet. Durch die Chelatbildung dieser Ionen verhindert EDTA, dass sie den Proteinreinigungsprozess stören
• Hemmung von Metalloproteasen: Viele Proteasen benötigen Metallionen für ihre Aktivität. EDTA hemmt diese Metalloproteasen, indem es die Metallionen bindet und dadurch die Zielproteine vor proteolytischer Degradation während der Reinigung schützt
• Verhinderung von Aggregation: Metallionen können manchmal dazu führen, dass Proteine aggregieren. Durch die Entfernung dieser Ionen hilft EDTA, die Löslichkeit und Stabilität der Proteine zu erhalten
• Entfernung von kontaminierenden Proteinen: Einige kontaminierende Proteine können Metallionen binden und mit dem Zielprotein ko-reinigt werden. EDTA kann dabei helfen, diese Kontaminanten zu entfernen, indem es ihre metallionenabhängigen Wechselwirkungen stört

Insgesamt wird EDTA verwendet, um die Ausbeute und Reinheit des Zielproteins zu verbessern, indem Degradation, Aggregation und Kontamination minimiert werden.

Vermeidung von Proteinaggregation während der Proteinreinigung ist entscheidend, um die Löslichkeit und Funktionalität der Proteine zu erhalten. Hier sind spezifische Strategien, die Sie während des gesamten Reinigungsprozesses umsetzen können:

Optimierung der Anfangsbedingungen

• Puffer-pH: Wählen Sie einen Puffer-pH, der nahe am pH der maximalen Stabilität des Proteins liegt, normalerweise leicht entfernt von seinem isoelektrischen Punkt (pI)
• Puffer-Ionenstärke: Verwenden Sie geeignete Salzkonzentrationen (z.B. NaCl), um das Protein zu stabilisieren und elektrostatische Wechselwirkungen zu reduzieren

Verwendung von Additiven

• Detergenzien: Nichtionische Detergenzien wie Triton X-100, Tween-20 oder CHAPS können Membranproteine stabilisieren und Aggregation verhindern
• Osmolyte: Additive wie Glycerin (5-20%), Saccharose oder Trehalose können Proteine durch bevorzugte Hydratation stabilisieren
• Reduktionsmittel: Fügen Sie DTT (Dithiothreitol) oder β-Mercaptoethanol hinzu, um Disulfidbrücken im reduzierten Zustand zu halten und die Bildung falscher Disulfidbrücken zu verhindern
• Chelatbildner: Verwenden Sie EDTA, um zweiwertige Metallionen zu chelatieren, die Aggregation fördern oder Proteasen aktivieren können

Protease-Inhibitoren

• Verwenden Sie einen Cocktail aus Protease-Inhibitoren (z.B. PMSF, Leupeptin, Aprotinin), um proteolytischen Abbau zu verhindern, der zur Aggregation führen kann

Temperaturkontrolle

• Führen Sie Reinigungsschritte bei 4°C durch, um die kinetische Energie und die Aggregationsneigung der Proteine zu reduzieren. Verwenden Sie gekühlte Puffer und halten Sie Proben auf Eis

Schonende Handhabung

• Vermeiden Sie kräftiges Mischen oder Vortexen. Verwenden Sie sanftes Pipettieren oder langsames Rühren, um mechanische Denaturierung zu verhindern. Minimieren Sie die Exposition gegenüber Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen, indem Sie übermäßige Schaumbildung vermeiden und Niedrigbindungsröhrchen verwenden

Optimale Proteinkonzentration

• Halten Sie die Proteinkonzentrationen auf optimalen Niveaus, um Aggregation zu minimieren. Hohe Konzentrationen können intermolekulare Wechselwirkungen fördern

Stabilisierende Mittel

• Polyole: Verbindungen wie PEG (Polyethylenglykol) können die Löslichkeit erhöhen und Aggregation verhindern
• Aminosäuren: Arginin (0,1-0,5 M) kann Proteine stabilisieren und Aggregation verhindern

Chromatographiebedingungen

• Verwenden Sie sanfte Elutionsbedingungen (z.B. graduelle Gradientelution), um abrupte Änderungen in der Pufferzusammensetzung zu vermeiden. Vermeiden Sie hohe Konzentrationen von Imidazol oder anderen Elutionsmitteln, die Proteine destabilisieren können

Richtige Lagerung

• Lagern Sie gereinigte Proteine in kleinen Aliquots, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden
• Verwenden Sie Kryoprotektoren wie 10-50% Glycerin oder Saccharose, um Proteine während des Einfrierens zu schützen

Verwendung von molekularen Chaperonen

• Ko-exprimieren Sie molekulare Chaperone während der rekombinanten Proteinexpression, um beim richtigen Falten zu helfen und Aggregation zu verhindern