Kompetente Zellen

Kompetente Zellen sind Bakterienzellen, die so behandelt wurden, dass sie fremde DNA leichter aufnehmen können. Dieser Prozess ist in der Gentechnik und Molekularbiologie für Klonierungszwecke unerlässlich. Kompetente Zellen können chemisch kompetent gemacht werden, indem man sie mit Calciumchlorid oder anderen Methoden behandelt, oder sie können elektrokompetent gemacht werden, indem man sie einem elektrischen Feld (Elektroporation) aussetzt. Diese Behandlungen machen die Zellmembran durchlässiger für DNA und erleichtern die Aufnahme von Plasmid-DNA während der Transformation.

Nicht-kompetente Zellen wurden nicht behandelt, um die DNA-Aufnahme zu verbessern, und daher ist ihre Fähigkeit, fremde DNA aufzunehmen, sehr gering oder vernachlässigbar. Diese Zellen werden im Allgemeinen nicht für Transformationsexperimente verwendet, da ihr natürlicher Zustand keine effiziente DNA-Aufnahme unterstützt. Nicht-kompetente Zellen können verwendet werden, um das Bakterienwachstum, den Stoffwechsel und die Physiologie unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen. Sie können auch verwendet werden, um die Expression endogener Gene ohne die Interferenz von Fremd-DNA zu untersuchen. In molekularbiologischen Experimenten können nicht-kompetente Zellen als negative Kontrollen dienen, um sicherzustellen, dass jede beobachtete Transformation auf die Behandlung und nicht auf die spontane Aufnahme von DNA zurückzuführen ist.

Kompetente Zellen können basierend auf ihren Herstellungsmethoden und spezifischen Anwendungen kategorisiert werden. Die verschiedenen Typen kompetenter Zellen sind:

1. Chemisch kompetente Zellen

Chemisch kompetente Zellen werden durch chemische Behandlungen, typischerweise Calciumchlorid, hergestellt, um die Zellmembran für DNA durchlässiger zu machen. Häufige Typen sind:

Standard kompetente Zellen: Geeignet für routinemäßiges Klonen und Plasmidvermehrung. Beispiele: DH5α, TOP10, JM109

Hocheffiziente kompetente Zellen: Entwickelt für hohe Transformationseffizienz, oft verwendet für das Klonen schwieriger oder wenig vorhandener DNA. Beispiele: XL10-Gold, DH5α High Efficiency

2. Elektrokompetente Zellen

Elektrokompetente Zellen werden für die Elektroporation vorbereitet, eine Methode, die ein elektrisches Feld verwendet, um DNA in Zellen einzuführen. Häufige Typen:

Standard elektrokompetente Zellen: Verwendet für routinemäßige Elektroporation mit moderater Transformationseffizienz. Beispiele: DH10B Elektrokompetent, TOP10 Elektrokompetent

Hocheffiziente elektrokompetente Zellen: Entwickelt für hocheffiziente Transformation, besonders nützlich für große Plasmide oder genomische DNA. Beispiele: GeneHogs Elektrokompetent, ElectroMAX DH5α

3. Spezialisierte kompetente Zellen

Diese Zellen sind für spezifische Anwendungen über das routinemäßige Klonen hinaus entwickelt.

Proteinexpressionskompetente Zellen: Optimiert für die Hochstufung der Expression rekombinanter Proteine. Beispiele: BL21(DE3), Rosetta(DE3), T7 Express

Mutagenesekompetente Zellen: Verwendet für ortsgerichtete Mutagenese und andere genetische Modifikationen. Beispiele: XL1-Blue, SURE

Klonen toxischer Gene kompetente Zellen: Entwickelt, um toxische oder instabile Gene zu vermehren. Beispiele: Stbl2, Stbl3

Transformation großer Plasmide: Speziell entwickelt, um große Plasmide oder BACs zu handhaben. Beispiele: EPI300, HST08

4. Kompetente Zellen für spezifische Screening-Anwendungen

Diese Zellen haben spezifische genetische Marker oder Eigenschaften, die beim Screening und der Auswahl helfen. Beispiele:

Blau-Weiß-Screening kompetente Zellen: Enthalten die lacZΔM15-Mutation für das Blau-Weiß-Screening rekombinanter Klone. Beispiele: DH5α, JM109

Gateway-Klonen kompetente Zellen: Optimiert für Gateway-Rekombinationsklonen. Beispiele: ccdB Survival cells

Die Wahl der kompetenten Zellen hängt von den spezifischen Bedürfnissen Ihres Experiments ab, wie Transformationseffizienz, Plasmidgröße, Proteinexpression, Mutagenese und Screening-Anforderungen.

Die Wahl kompetenter Zellen hängt von mehreren Faktoren ab, die mit Ihren spezifischen experimentellen Bedürfnissen zusammenhängen. Hier sind wichtige Überlegungen und Schritte, die Ihnen helfen, die richtigen kompetenten Zellen auszuwählen:

1) Transformationseffizienz

Wenn Sie ein Gen klonieren oder eine Bibliothek konstruieren müssen, bei der eine hohe Transformationseffizienz entscheidend ist, wählen Sie Zellen, die als "hohe Effizienz" gekennzeichnet sind.

Für routinemäßiges Klonieren, bei dem eine extrem hohe Effizienz nicht erforderlich ist, standardkompetente Zellen.

2) Zellstamm

E. coli Stämme: Häufige Stämme sind DH5α, TOP10 und JM109, die jeweils unterschiedliche Vorteile bieten, wie hohe Transformationseffizienz, verbesserte Plasmidausbeute oder Fähigkeit zur Blau-Weiß-Screening

Spezialisierte Stämme: Für spezifische Anwendungen wie Proteinexpression, Mutagenese oder Vermehrung toxischer Gene können spezialisierte Stämme wie BL21 (für Proteinexpression) oder XL1-Blue (für Mutagenese) geeigneter sein

3) Kompatibilität mit Plasmid- oder DNA-Typ

Stellen Sie sicher, dass die von Ihnen gewählten kompetenten Zellen mit dem Plasmidvektor oder der DNA, die Sie verwenden möchten, kompatibel sind. Einige Stämme sind beispielsweise für Hochkopie-Plasmide optimiert, während andere besser für Niedrigkopie- oder große Plasmide geeignet sind

4) Antibiotikaresistenz

Überprüfen Sie, ob die Antibiotikaresistenzmarker auf dem Plasmid mit den Selektionsmarkern der kompetenten Zellen kompatibel sind

5) Genotypische Merkmale

Einige Anwendungen erfordern möglicherweise spezifische genotypische Merkmale, wie recA- (um Rekombination zu verhindern) oder endA- (um Plasmidausbeute und -qualität zu verbessern)

Beispiel für die Auswahl kompetenter Zellen

Für routinemäßiges Klonieren: DH5α oder TOP10 Zellen werden häufig verwendet, da sie eine hohe Transformationseffizienz und Zuverlässigkeit bieten

Für Proteinexpression: BL21(DE3) Zellen werden oft gewählt, weil sie für die Hochleistungsexpression rekombinanter Proteine ausgelegt sind

Für schwieriges Klonieren: Für das Klonieren großer Plasmide oder toxischer Gene könnten Sie einen Stamm wie Stbl3 oder SURE Zellen wählen