Die Isolation und Reinigung von RNA sind entscheidende Schritte in der Molekularbiologie, um die Genexpression zu untersuchen, RNA zu sequenzieren oder andere nachgelagerte Anwendungen durchzuführen. Einige gängige Methoden zur RNA-Isolation und -Reinigung sind:

• Phenol-Chloroform-Extraktion (TRIzol-Reagenz): Verwendet Phenol und Chloroform, um RNA von anderen Zellkomponenten zu trennen
• Silica-Membran-basierte Säulenreinigung: Verwendet Zentrifugationssäulen mit Silica-Membranen, um RNA zu binden und zu eluieren
• Magnetperlen-basierte Reinigung: Verwendet magnetische Perlen, die mit RNA-bindenden Molekülen beschichtet sind, für hohen Durchsatz und Automatisierung
• Ultrazentrifugation im Cesiumchlorid-Gradienten: Trennt RNA basierend auf der Dichte durch Ultrazentrifugation

Poly(A)-Selektion:

• Oligo(dT)-Cellulose-Chromatographie: Isoliert mRNA durch Bindung an ihren Poly(A)-Schwanz
• Magnetische Oligo(dT)-Perlen: Ähnlich wie Cellulose-Chromatographie, aber verwendet magnetische Perlen
• Lithiumchlorid-Präzipitation: Präzipitiert selektiv RNA mit hohem Molekulargewicht
• Enzymatische Verdauung (DNase-Behandlung): Entfernt DNA-Kontamination durch Verdauung der DNA mit DNase

Jede dieser Methoden hat ihre Vor- und Nachteile in Bezug auf Ertrag, Reinheit, Einfachheit und Eignung für verschiedene Arten von Proben und nachgelagerte Anwendungen. Die Wahl der Methode hängt oft von den spezifischen Anforderungen des Experiments und der Art der verarbeiteten Probe ab.

Die RNA-Isolation umfasst eine Vielzahl von Chemikalien, um Zellen zu lysieren, RNasen zu hemmen und RNA von anderen Zellkomponenten zu trennen. Einige wichtige Chemikalien, die häufig in der RNA-Isolation verwendet werden, sind:

• Guanidiniumthiocyanat: Ein chaotroper Wirkstoff, der Proteine denaturiert und RNA vor RNase-Abbau schützt. In Reagenzien wie TRIzol enthalten
• Phenol: Wird in der Phenol-Chloroform-Extraktion verwendet, um Proteine zu denaturieren und sie von der RNA zu trennen
• Chloroform: Wird mit Phenol gemischt, um ein biphasisches System zu schaffen, das RNA in die wässrige Phase trennt
• Isopropanol oder Ethanol: Wird verwendet, um RNA nach der Extraktion aus der wässrigen Phase zu präzipitieren
• Natriumacetat: Wird häufig zur wässrigen Phase hinzugefügt, um die Präzipitation von RNA während der Alkoholpräzipitation zu unterstützen
• DNase I: Ein Enzym, das verwendet wird, um kontaminierende DNA in RNA-Präparationen zu verdauen
• TRIzol-Reagenz: Eine kommerzielle Lösung, die Guanidiniumthiocyanat, Phenol und andere Komponenten zur RNA-Extraktion enthält
• Silica-Membran-Puffer: Puffer, die chaotrope Salze (wie Guanidiniumchlorid) und Ethanol enthalten und in der Silica-Säulen-basierten RNA-Reinigung verwendet werden
• Lithiumchlorid: Wird zur selektiven Präzipitation von RNA verwendet, insbesondere von RNA mit hohem Molekulargewicht
• Magnetic Beads: Beschichtet mit Oligo(dT) oder anderen Molekülen zur Bindung von RNA, verwendet in Perlen-basierten Reinigungsmethoden

Diese Chemikalien sind entscheidend für die effektive Isolierung und Reinigung von RNA, während sie den Abbau und die Kontamination verhindern.

Das Vermeiden von DNA-Kontamination während der RNA-Isolation ist entscheidend, um die Reinheit des RNA-Probenmaterials zu gewährleisten. Hier sind mehrere Strategien zur Minimierung der DNA-Kontamination:

1. Nach der Isolation der RNA behandeln Sie die Probe mit DNase, um verbleibende DNA abzubauen. Kommerzielle RNase-freie DNase-Kits sind zu diesem Zweck erhältlich.
2. Verwenden Sie starke denaturierende Mittel wie Guanidiniumthiocyanat während des Zelllyse-Schritts. Diese Mittel helfen bei der Denaturierung von Proteinen, einschließlich Nukleasen, die RNA abbauen könnten.
3. Arbeiten Sie in einer sauberen Umgebung und verwenden Sie steriles, RNase-freies Equipment und Reagenzien. Vermeiden Sie Kreuzkontaminationen, indem Sie häufig die Handschuhe wechseln und spezielle Pipetten und Spitzen verwenden.
4. Befolgen Sie Protokolle, die Schritte zur selektiven Präzipitation von RNA beinhalten, während DNA ausgewaschen wird. Ethanol- und Isopropanolpräzipitationsschritte können helfen, RNA zu reinigen.
5. Kommerzielle RNA-Isolationskits sind so konzipiert, dass sie DNA-Kontamination minimieren. Diese Kits enthalten oft Schritte zur selektiven Bindung und zum Waschen der RNA.
6. Bei der Verwendung von Säulen-basierten Isolationsmethoden überladen Sie die Säulen nicht mit zu viel Probe, da dies zu einer unvollständigen Entfernung von DNA führen kann.
7. Führen Sie gelegentlich Schein-Isolationen (ohne Proben) durch, um sicherzustellen, dass Ihre Reagenzien und Geräte nicht mit DNA kontaminiert sind.
8. Nach der Isolation überprüfen Sie die DNA-Kontamination durch PCR, die auf eine spezifische DNA-Sequenz abzielt. Wenn eine Amplifikation erfolgt, weist dies auf die Anwesenheit von DNA-Kontamination hin.

Durch Befolgung dieser Schritte können Sie das Risiko einer DNA-Kontamination in Ihren RNA-Proben erheblich reduzieren.