Restriktionsenzyme

Die Hauptfunktion eines Restriktionsenzyms besteht darin, DNA an spezifischen Sequenzen, die als Erkennungsstellen bekannt sind, zu schneiden. Dieser Prozess umfasst mehrere wichtige Schritte:

1. Erkennung: Das Enzym bindet an eine spezifische DNA-Sequenz. Jedes Restriktionsenzym erkennt eine bestimmte Nukleotidsequenz, die typischerweise palindromisch ist (liest sich auf komplementären Strängen vorwärts und rückwärts gleich).
2. Bindung: Das Enzym bindet an die DNA an der Erkennungsstelle. Diese Bindung beinhaltet Wechselwirkungen zwischen dem Enzym und der spezifischen Nukleotidsequenz.
3. Spaltung: Das Enzym spaltet das Rückgrat der DNA an spezifischen Stellen innerhalb oder in der Nähe der Erkennungsstelle. Diese Spaltung kann zu "glatten Enden" oder "klebrigen Enden" führen.
   • Glatte Enden: Die DNA wird gerade durch beide Stränge geschnitten, was zu gleichmäßigen Enden führt.
   • Klebrige Enden: Die DNA wird versetzt geschnitten, was zu überhängenden einzelsträngigen Enden führt, die sich leicht mit komplementären Sequenzen paaren können.

Zum Beispiel erkennt das Restriktionsenzym EcoRI die palindromische Sequenz 5'-GAATTC-3' und schneidet zwischen dem G und dem A auf jedem Strang, wodurch klebrige Enden entstehen:

Dies ergibt:

5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAA↑G-5’​5’-GAATTC-3’ ​3’-CTTAA↑G-5’​

und

5’-G 3’-CTTAA AATTC-3’ G-5’​5’-G ​3’-CTTAA ​AATTC-3’ ​G-5’​

Die Restriktionsenzyme werden in vier Haupttypen eingeteilt, basierend auf ihrer Struktur, Erkennungssequenz, Schnittstelle und den Anforderungen an Kofaktoren. Hier ist eine Übersicht über jeden Typ:

1. Typ I Restriktionsenzyme
   Diese Enzyme schneiden DNA an zufälligen Stellen, die weit von ihren Erkennungssequenzen entfernt sind. Sie sind komplexe, mehrteilige Enzyme mit sowohl Restriktions- als auch Modifikationsaktivitäten (Methylierung). Sie erkennen spezifische Sequenzen, schneiden die DNA jedoch an Stellen, die Hunderte bis Tausende von Basenpaaren von der Erkennungsstelle entfernt sein können. Erfordern ATP und S-Adenosylmethionin (SAM) für ihre Aktivität.

2. Typ II Restriktionsenzyme
   Diese Enzyme schneiden DNA an spezifischen Stellen innerhalb oder in der Nähe ihrer Erkennungssequenzen. Sie sind im Allgemeinen einfacher und bestehen normalerweise aus einer einzigen Untereinheit. Sie erkennen spezifische palindromische Sequenzen, typischerweise 4-8 Basenpaare lang, und schneiden die DNA an oder in der Nähe dieser Stellen. Erfordern Mg²⁺ als Kofaktor, benötigen jedoch kein ATP. Diese Enzyme werden aufgrund ihrer vorhersehbaren und präzisen Schnittmuster häufig in der Molekularbiologie für das Klonen, die DNA-Kartierung und andere genetische Manipulationen verwendet.

3. Typ III Restriktionsenzyme
   Diese Enzyme schneiden DNA an Stellen, die eine kurze Entfernung von ihren Erkennungssequenzen entfernt sind. Sie bestehen aus zwei Untereinheiten: einer für die Restriktion und einer für die Modifikation. Sie erkennen spezifische Sequenzen und schneiden die DNA 20-30 Basenpaare von der Erkennungsstelle entfernt. Erfordern ATP für die Restriktionsaktivität und SAM für die Modifikationsaktivität.

4. Typ IV Restriktionsenzyme
   Diese Enzyme erkennen und schneiden spezifisch modifizierte DNA, wie methylierte oder hydroxymethylierte DNA. Sie sind typischerweise komplex, aber die genaue Struktur kann variieren. Sie erkennen modifizierte Basen innerhalb spezifischer Sequenzen. Erfordern normalerweise Mg²⁺ als Kofaktor, aber die Spezifikationen können je nach Enzym variieren.

Typ II Enzyme sind die am häufigsten verwendeten, da sie präzise und vorhersehbare Schnittmuster bieten.

Bei der Auswahl von Restriktionsenzymen für eine spezifische molekularbiologische Anwendung sollten Sie diese fünf wichtigen Punkte berücksichtigen, um eine erfolgreiche und effiziente DNA-Manipulation zu gewährleisten:

1. Erkennungssequenz

Wählen Sie ein Enzym, das eine spezifische Sequenz innerhalb Ihrer interessierenden DNA erkennt. Stellen Sie sicher, dass die Erkennungssequenz an der gewünschten Stelle in der DNA vorhanden ist und in anderen Bereichen, in denen keine Schnittstelle gewünscht ist, fehlt. Berücksichtigen Sie die Länge der Erkennungssequenz. Enzyme, die längere Sequenzen erkennen (z.B. 8 Basenpaare), schneiden weniger häufig als solche, die kürzere Sequenzen erkennen (z.B. 4 Basenpaare).

2. Schnittmuster

Bestimmen Sie, ob Sie glatte Enden oder klebrige (kohäsive) Enden benötigen. Klebrige Enden werden oft für das Klonen bevorzugt, da sie die Ligation von DNA-Fragmenten erleichtern. Stellen Sie sicher, dass das Enzym an der gewünschten Position innerhalb oder in der Nähe der Erkennungsstelle schneidet.

3. Reaktionsbedingungen

Überprüfen Sie die Pufferanforderungen für das Enzym. Wenn mehrere Enzyme in einer einzigen Reaktion verwendet werden, stellen Sie sicher, dass ein kompatibler Puffer vorhanden ist oder dass die Pufferbedingungen ohne Aktivitätsverlust angepasst werden können. Überprüfen Sie die optimale Temperatur für die Enzymaktivität. Die meisten Restriktionsenzyme arbeiten am besten bei 37°C, aber einige benötigen unterschiedliche Temperaturen. Einige Restriktionsenzyme sind empfindlich gegenüber DNA-Methylierung. Stellen Sie sicher, dass das von Ihnen ausgewählte Enzym methylierte DNA schneiden kann, wenn Ihr DNA-Probe wahrscheinlich methyliert ist.

4. Sternaktivität

Seien Sie sich der "Sternaktivität" bewusst, bei der ein Enzym unter nicht optimalen Bedingungen (z.B. hohe Glycerinkonzentration, niedrige Ionenstärke, hoher pH-Wert) an Stellen schneidet, die ähnlich, aber nicht identisch mit seiner Erkennungssequenz sind. Um die Sternaktivität zu minimieren, verwenden Sie das Enzym unter optimalen Bedingungen, wie vom Hersteller empfohlen.

5. Verfügbarkeit und Kosten

Stellen Sie sicher, dass das Enzym von zuverlässigen Lieferanten leicht verfügbar ist. Berücksichtigen Sie die Kosten des Enzyms, insbesondere wenn große Mengen oder mehrere Enzyme für Ihre Experimente benötigt werden. Wählen Sie hochqualitative, hochgereinigte Enzyme, um konsistente und zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten.

Beispielszenario

Wenn Sie beispielsweise ein Gen in einen Plasmidvektor klonen, könnten Sie ein Enzym wie EcoRI auswählen, das klebrige Enden erzeugt. Sie würden sicherstellen, dass die Erkennungssequenz (5'-GAATTC-3') sowohl an der Klonierungsstelle im Gen als auch im Vektor vorhanden ist. Sie würden überprüfen, ob EcoRI mit dem in Ihrer Reaktion verwendeten Puffer kompatibel ist, optimal bei 37°C arbeitet und nicht durch Methylierung gehemmt wird, wenn Ihre DNA methyliert ist.