Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist ein grundlegendes Werkzeug in jedem Labor, das mit Nukleinsäuren arbeitet, z. B. in Krebsforschungslabore (sehen Sie sich hier unsere besten Produkte für die Krebsforschung an) die erstaunlich genaue Messungen liefern können. Viele Wissenschaftler haben jedoch immer noch Schwierigkeiten, jedes Mal zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Im Folgenden finden Sie einige häufige Fehler, die die Ursache für Ihre qPCR-Probleme sein könnten, und unsere Vorschläge, wie Sie diese vermeiden können.
1. Ihre Probe wurde kontaminiert
DNA ist überall, und wenn Sie keine entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen ergreifen, wird sie auch in Ihre Probe gelangen. Außerdem können andere Verunreinigungen wie Hämoglobin, Ethanol und Phenol die PCR hemmen.
Es gibt viele Punkte, an denen Verunreinigungen in Ihre Proben gelangen können. Im Folgenden finden Sie einige Tipps, wie Sie das Risiko einer kontaminierten Probe minimieren können.
- Der erste Schritt ist ein sauberer Arbeitsbereich. Ein PCR-Arbeitsplatz (auch bekannt als Clean Benches, Laminar Flow Hoods usw.) ist ein guter Anfang. PCR-Arbeitsplätze verhindern Hintergrund- und Kreuzkontaminationen, indem sie alle Kontaminanten in der Luft von den Proben fernhalten.
- Alle Oberflächen im PCR-Bereich sollten routinemäßig mit einer DNA-Dekontaminationslösung dekontaminiert werden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
- Halten Sie mehrere Pipettensätze bereit und bewahren Sie die Pipetten für die verschiedenen Arbeitsschritte getrennt auf.
- Erwägen Sie die Einbeziehung einer Minus-Reverse-Transkriptase-Kontrolle (oder „No Amplification Control“ / NAC) in qRT-PCR-Experimente. Dabei handelt es sich in der Regel um eine simulierte reverse Transkription, die alle RT-PCR-Reagenzien außer der reversen Transkriptase enthält. Wenn in der NAC ein Signal zu sehen ist, bedeutet dies wahrscheinlich, dass Ihre Probe eine DNA-Kontamination enthält.
- Sie können auch ein Spektralphotometer verwenden, um eine Vorstellung von der DNA-Konzentration und -Qualität zu bekommen. Das Verhältnis der Absorption bei 260 und 280 nm (A260/280) sollte im Bereich von 1,8-2,0 liegen. Weicht es davon ab, sind Ihre Proben möglicherweise durch Salze, Lösungsmittel oder Proteine verunreinigt. Wenn eine Kontamination vorliegt, führen Sie ein Reinigungsprotokoll durch, z. B. ein Clean-up-Kit.
2. Ihre Probe hat sich verschlechtert
Degradierte RNA sieht auf einem Agarosegel wie ein Schlieren aus und bildet keine erkennbaren ribosomalen RNA-Banden. Aber wie ist das passiert? Nun, es gibt mehrere Dinge zu beachten, wenn Sie Ihre Probe in einem guten Zustand halten wollen, um sie einer PCR zu unterziehen.
- Lagern Sie Ihre Proben richtig. Es kann nicht hoch genug eingeschätzt werden, wie wichtig es ist, in die richtige Lagerung Ihrer Proben zu investieren. Wenn sie empfindlich auf Umweltfaktoren reagieren, müssen Sie 100%ig sicher sein, dass diese Faktoren unter Kontrolle sind. Die Lagerung von Proben umfasst alles, von den Geräten, über die Fläschchen, bis hin zum Puffer, und Sie brauchen ein System, mit dem Sie überwachen können ob Ihre Proben durch eine Veränderung der Umgebung gefährdet sind. Vor allem, wenn Ihre Probe selten, schwierig zu beschaffen oder teuer ist, macht es keinen Sinn, nicht in die richtige Pflege zu investieren und einen RNA-erhaltenden Puffer zu verwenden. Wir können dies nicht genug betonen. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Ihre Proben so frisch wie möglich sind, also vermeiden Sie es, sie mehrmals aufzutauen oder einzufrieren.
- Ihre Probe könnte mit Nuklease-Enzymen verunreinigt worden sein. Achten Sie darauf, dass Sie Ihren Arbeitsbereich immer ordnungsgemäß mit einer RNase-Inaktivierungslösung reinigen.Sie können Ihrer Lösung auch ein Reagenz wie RNAsecure™ hinzufügen, um RNase-Verunreinigungen in Ihrer Probe zu entfernen.
- Die meisten kommerziellen PCR-Kits enthalten einen RNase-Inhibitor, und das aus gutem Grund. Wenn Sie noch ein Kit verwenden, das keinen Inhibitor enthält, ist es vielleicht an der Zeit, auf ein Kit mit Inhibitor umzusteigen.
- Schließlich ist es wichtig, dass Sie nur nukleasefreies Wasser verwenden. Sie können es gebrauchsfertig kaufen oder im Labor selbst herstellen.
3. Nicht das richtige Primer- und Sondendesign
- Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten Sie unbedingt eine Primer-Design-Software verwenden. Das NCBI bietet eine kostenlose Primer-Design-Plattform an die Sie sich ansehen können.
- Beim Design von Amplikons in eukaryotischen Zielmolekülen sollten Sie PCR-Primer wählen, die mindestens eine Exon-Exon-Verbindung in der mRNA des Zielmoleküls abdecken, um zu verhindern, dass die Amplifikation des Zielmoleküls genomische DNA kontaminiert.
- Beim Primerdesign sind auch die Primär- und Sekundärstrukturen zu berücksichtigen, die sich auf die Reaktion auswirken können, und eine Software kann Ihnen dabei helfen, diese zu umgehen.
- Idealerweise sollte man Regionen mit vielen Basenpaarwiederholungen vermeiden, aber das ist natürlich nicht immer möglich.
- Regionen, die zu mehr als 60 % aus GC bestehen, können besonders knifflig sein, da sie nicht nur recht thermostabil sind, sondern aufgrund ihrer "Biegsamkeit" auch dazu neigen, Sekundärstrukturen wie Haarnadeln zu bilden. Glücklicherweise gibt es kommerziell erhältliche Hilfsmittel, die Ihnen helfen können, dieses Problem zu lösen, wie z. B. die richtige Mastermischung oder Polymerase.
4. Keine Master-Mixe verwenden
Das bringt uns zum nächsten Punkt.
qRT-Tests sind extrem empfindliche und effiziente Werkzeuge für die Vervielfältigung von RNA, was großartig ist, bis sie auch Fehler verstärken. Natürlich sollte die Variabilität zwischen den Wells und Proben so gering wie möglich gehalten werden und die Reproduzierbarkeit so hoch wie möglich. Hier kommen Master-Mixe ins Spiel. Um die Schwankungen von Well zu Well weiter zu reduzieren, kann dem Master-Mix ein Referenzfarbstoff wie ROX zugesetzt werden.
5. Benutzerfehler
Niemand ist perfekt, und vor allem bei kniffligen und sich oft wiederholenden Arbeiten können Fehler passieren. Es gibt ein paar häufige Fehler, die passieren können, vor allem, wenn man müde oder hungrig ist.
Sie haben vergessen, etwas hinzuzufügen
Sie erhalten seltsame Ergebnisse? Überhaupt keine Ergebnisse? Es ist möglich, dass Sie einfach vergessen haben, Ihrer Reaktion etwas Wichtiges hinzuzufügen. Gehen Sie Ihre Schritte noch einmal durch und prüfen Sie, ob Sie etwas vergessen haben.
Die falschen PCR-Bedingungen verwendet
Viele Geräte bieten Ihnen die Möglichkeit, Ihre persönlichen Einstellungen zu speichern. Das ist sehr praktisch, wenn mehrere Gruppen mit unterschiedlichen Protokollen an einem Gerät arbeiten, denn so können Sie Ihr Experiment jedes Mal viel schneller einrichten, aber es kann sich natürlich als Fallstrick erweisen, wenn Sie zufällig die falsche Einstellung für Ihre Reaktion wählen. Vergewissern Sie sich immer, dass Sie die richtige Einstellung gewählt haben bevor Sie beginnen.
Zu hohe Bindungstemperatur verwendet
Manchmal kann es schwierig sein, die beste Temperatur für Ihre Reaktion zu finden. Eine gute Möglichkeit, die beste Temperatur zu finden, ist die Verwendung eines PCR-Geräts mit Gradientenfunktion. Eine gute Möglichkeit, die beste Temperatur zu finden, ist die Verwendung eines PCR-Geräts mit Gradientenfunktion. Sie können eine Gradienten-PCR durchführen, um verschiedene Annealing-Temperaturen auf einmal zu testen, die Sie dann vergleichen und die Temperatur auswählen können, die die hellste gewünschte Bande ergibt.
Vergessen, Farbstoff zum Agarosegel hinzuzufügen
Wenn Sie ein Gel herstellen und in Ihren Ergebnissen nichts zu sehen ist, haben Sie vielleicht vergessen, einen Farbstoff hinzuzufügen. Eine bequeme Lösung wäre, ein vorgefertigtes Gel zu kaufen, in dem der Farbstoff bereits enthalten ist.
Zusätzlich zu diesen Hilfsmitteln und Tipps, die Ihnen das Leben im Labor erleichtern und die Wahrscheinlichkeit solcher Benutzerfehler verringern, empfehlen wir Ihnen auch, regelmäßig Pausen einzulegen, ausreichend zu schlafen, und zu essen.