Wie können Gefriergeräte mit kontrollierter Abkühlrate eingesetzt werden, um Proben und Therapien für die langfristige kryogene Lagerung vorzubereiten?
Der Begriff „Kryokonservierung“ leitet sich vom griechischen Wort „kryos“ ab, das „Kälte“ bedeutet. Praktisch handelt es sich bei der Kryokonservierung um eine Methode zur Erhaltung biologischer Proben in einem verglasten (vitrifizierten) Zustand.
Schnelles Einfrieren verhindert die Bildung von Eiskristallen, indem die Probe in die amorphe Eisphase überführt wird, während die hexagonale Eisphase umgangen wird. Aufgrund der sehr niedrigen Temperaturen bei der Kryokonservierung wird das Wasser in den Zellen entweder vitrifiziert oder durch Osmose entfernt, wodurch metabolische Prozesse zum Stillstand kommen.
Vorteile der Kryokonservierung von Proben:
- Geringeres Risiko mikrobieller Kontamination oder Kreuzkontamination
- Geringeres Risiko morphologischer und/oder genetischer Veränderungen
- Etablierte Techniken mit gut dokumentierten Methoden und Ergebnissen
Die Kryokonservierung ist effektiv, jedoch nicht frei von Herausforderungen. Forschende müssen optimale Bedingungen für die Lebensfähigkeit und Wiedergewinnung ihrer Proben bestimmen.
Was sind die Gefrierphasen?
Die ISBER-Richtlinien besagen, dass die Kryokonservierung mit flüssigem Stickstoff (LN₂) optimal für die langfristige Lagerung von Proben ist. Diese Systeme ermöglichen Lagerbedingungen unterhalb der Glasübergangstemperatur von -132 °C. Der Begriff „Glas“ bezieht sich hierbei auf eine Flüssigkeit, die zu kalt ist, um zu fließen.
Die Nukleation beschreibt den Beginn des Übergangs von flüssig zu kristallin. Dabei trennt sich Eis schrittweise von der noch nicht gefrorenen Lösung. Während Wasser als Eis auskristallisiert, steigt die Konzentration der gelösten Stoffe. Dieser Prozess ist auch mit einer Energieänderung verbunden. Der lokale Temperaturanstieg wird als latente Schmelzwärme bezeichnet und tritt auf, wenn die Lösung den Gleichgewichtsgefrierpunkt erreicht.
Best Practices
Während die Lagerung unterhalb der Glasübergangstemperatur entscheidend ist, ist die richtige Vorbereitung der Proben für sehr niedrige Temperaturen ebenso wichtig. Eine kontrollierte Gefrierrate erhöht die Zellviabilität, wenn die Probe später aus dem kryogenen Zustand entnommen wird.
Die International Society for Biological and Environmental Repositories (ISBER) veröffentlicht die „ISBER Best Practices: Recommendations for Biorepositories, Fourth Edition“, die Richtlinien zur Probenkonservierung enthalten. 2019 wurde zudem das Addendum „Liquid Nitrogen-Based Cryogenic Storage of Specimens“ veröffentlicht.
Diese Richtlinien umfassen evidenz- und konsensbasierte Best Practices für die Sammlung, langfristige Lagerung, Wiedergewinnung und Verteilung biologischer und umweltbezogener Proben und unterstützen die Bereitstellung hochwertiger Forschungsproben.
Thermo Scientific CryoMed Gefriergeräte mit kontrollierter Abkühlrate
Gefriergeräte mit kontrollierter Abkühlrate helfen, den Stress für Proben während des Einfrier- und Vitrifikationsprozesses zu reduzieren.
CryoMed Geräte verfügen über sechs werkseitig voreingestellte Gefrierprofile, und Nutzer können bis zu 14 benutzerdefinierte Profile erstellen. Für Proben und Therapien steht zudem ein neues voreingestelltes Profil mit einer Endtemperatur von -140 °C zur Verfügung.
Dieses Profil, „Pre-Set Profile #3“, steuert den Gefrierprozess durch die Glasübergangsphase (in der amorphes Eis entstehen kann). Es ermöglicht eine Abkühlrate von 1 °C pro Minute von der Nukleation bis -45 °C und anschließend 10 °C pro Minute bis zur Endtemperatur von -140 °C. Es wird häufig für hämatopoetische Stammzellen in Volumina von 65 bis 100 mL eingesetzt.
Langfristige Probenlagerung
Für die langfristige Lagerung stehen zwei LN₂-Kryolagerplattformen zur Auswahl:
- Thermo Scientific CryoExtra hocheffiziente LN₂-Lagertanks
- Thermo Scientific CryoPlus LN₂-Lagersysteme
Bei der Auswahl der passenden Plattform sollten die Anzahl der Proben sowie die Nutzung von flüssigem oder gasförmigem Stickstoff berücksichtigt werden:
- CryoExtra eignet sich für große Probenzahlen in der Gasphase; vier Kapazitätsoptionen bieten Platz für 19.500 bis 93.000 Vials (2 mL)
- CryoPlus eignet sich für kleinere Probenzahlen und unterstützt sowohl Flüssig- als auch Gasphasenlagerung; die Kapazität für 2 mL Vials liegt zwischen 6.318 und 39.000
Thermo Scientific CryoMed Gefriergeräte mit kontrollierter Abkühlrate, kombiniert mit CryoExtra- oder CryoPlus-Systemen, bieten eine durchgängige Workflow-Lösung für Labore und Biobanken – von der zuverlässigen Probenvorbereitung bis zur sicheren kryogenen Lagerung.
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