Invitrogen™ Thiol Fluorescent Detection Kit

Das Kit zum Nachweis von Protein-Thiol, das nur für Forschungszwecke verwendet wird, ist ein Fluoreszenztest, der für die Quantifizierung und den Nachweis von Protein-Thiol in gemeinsamen biologischen Puffern, einschließlich biologischen Puffern, wie Tris-, Phosphat- und Citratpuffern, entwickelt wurde.

Dieses vollständige, gebrauchsfertige Kit enthält schwarze 96-Well-Mikrotiterplatte(n), N-Acetylcystein-Standard, Nachweisreagenz, Assaypuffer und andere Komponenten für die Durchführung des Assays. Für die Verwendung dieses Kits ist ein 96-Well-Mikrotiterplatten-Lesegerät erforderlich, das die Fluoreszenzemissionen bei 510 nm mit Anregung bei 390 nm ablesen kann.

Leistungsmerkmale
• Assay-Typ: Fluoreszenznachweiskit
• Probentypen: gängige biologische Puffer einschließlich biologischer Puffer, wie Tris-, Phosphat- und Citratpuffer
• Empfindlichkeit: 4,62 nM
• Standardkurvenbereich: 78 bis 10.000 nmol
• Reaktivität: artunabhängig

Hintergrund
Freie Thiole in biologischen Systemen spielen eine wichtige Rolle. Oxidativ modifizierte Thiol-Gruppen von Cystein-Rückständen sind bekannt dafür, die Aktivität einer wachsenden Anzahl von Proteinen zu modulieren. Eines der drängendsten Probleme bei diesem Ansatz besteht darin, das Ausmaß der Modifikation bestimmter Aminosäuren, wie z. B. Cystein-Rückstände, in einer komplexen Proteinprobe genau zu bestimmen, insbesondere in Gegenwart von chaotropen Substanzen wie Guanidinhydrochlorid.

Mit diesem Thiol-Fluoreszenznachweis-Kit können Anwender den Gehalt von freiem Thiol in Proben mit einem firmeneigenen, nicht fluoreszierenden Nachweisreagenz, das bei der Reaktion mit dem Thiol in der Probe in ein hell fluoreszierendes Produkt umgewandelt wird, genau bestimmen. Das Thiol in der Probe kann entweder ein solches sein, das durch eine Reaktion erzeugt wird, z. B. das Endprodukt einer enzymatischen Reaktion wie Glutathion, oder der Cystein-Gehalt des zu messenden Proteins. Dieser Assay wurde mit Proben in Guanidinhydrochlorid-Konzentrationen von bis zu 2 M in dem im Kit mitgelieferten Assaypuffer getestet. Dadurch kann der Thiolgehalt von entfalteten Proteinen genau bestimmt werden. Obwohl ein Cystein-Derivat als Standard bereitgestellt wurde, mit dem freie Cysteine auf Peptiden und Proteinen quantifiziert werden können, sollte der Assay auf einen Standard kalibriert werden, der so nah wie möglich chemisch an dem zu messenden Thiol liegt. Wenn der Endanwender beispielsweise Glutathion mit dem Kit misst, sollte der Assay auf eine bekannte, validierte Glutathion-Standardpräparation kalibriert werden.

Assay-Prinzip
Das Protein-Thiol-Fluoreszenznachweis-Kit wurde entwickelt, um Thiol-Gruppen quantitativ zu messen, die in biologischen Proben erzeugt oder vorhanden sind. Ein Standard wird zur Erstellung einer Standardkurve für den Assay bereitgestellt, und alle Proben sollten von der erstellten Standardkurve abgelesen werden. Proben und Standards werden in eine schwarze Mikrotiterplatte pipettiert. Nach dem Mischen der Probe oder des Standards mit dem Detektionsreagenz und dem Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten wird das fluoreszierende Produkt bei 510 nm in einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät mit Anregung bei 390 nm gelesen. Da biologisch erzeugte freie Thiole wie Glutathion und Protein-Thiol-Gruppen in verschiedenen Umgebungen existieren, sollte die Menge des vorhandenen oder erzeugten Thiols mit einem geeigneten Standard kalibriert werden.