Invitrogen™ SuperScript™ III Erststrang-Synthese SuperMix für qRT-PCR

SuperScript® III First-Strand Synthesis SuperMix für qRT-PCR bietet die hohe Temperaturbeständigkeit der SuperScript® III Reverse Transkriptase in einem optimierten SuperMix-Format für die Synthese der Erststrang-cDNA zur Verwendung in quantitativen Real-Time PCR (qRT-PCR). Der einfache, zeitsparende Reaktionsaufbau verwendet lediglich zwei Röhrchen: ein 2X Reaktionsgemisch und ein Enzymgemisch.

Das Enzymgemisch
Die im RT-Enzymgemisch enthaltene SuperScript® III Reverse Transkriptase ist eine Version der M-MLV-RT, die zur Reduzierung der RNase H-Aktivität entwickelt wurde und eine höhere thermische Stabilität bietet. Das Enzym kann zur Synthese von cDNA bei Temperaturen von 42 – 60 °C verwendet werden und bietet eine bessere Spezifität, höhere cDNA-Ausbeute und mehr Produkt in voller Länge als andere reverse Transkriptasen. Da SuperScript® III RT nicht signifikant von ribosomaler und Transfer-RNA gehemmt wird, kann sie für die Synthese von cDNA aus Gesamt-RNA verwendet werden. Der ebenfalls im Enzymgemisch enthaltene RNaseOUT™ Rekombinante Ribonuklease-Inhibitor ist ein RNase-Inhibitorprotein, das gegen den Abbau von Ziel-RNA aufgrund von Ribonuklease-Kontaminierung der RNA-Vorbereitung schützt.

Reaktionsgemisch
Das 2X RT-Reaktionsgemisch enthält Oligo(dT)₂₀, Random-Hexamers, MgCl₂ und dNTPs in einer Pufferformulierung, die für qRT-PCR optimiert wurde. E. coli RNase H wird als ein separates Röhrchen im Kit geliefert, um das RNA-Template aus dem cDNA:RNA-Hybridmolekül nach der Erststrang-Synthese zu entfernen. Dies führt nachweislich zur Erhöhung der Empfindlichkeit in qRT-PCR.

Verwendung von SuperScript® III SuperMix für die Erststrang-Synthese
Diese SuperMix-Formulierung kann verwendet werden, um weniger als 10 Kopien eines Ziel-Gens in qRT-PCR mit einem breiten dynamischen Bereich, der eine genaue Quantifizierung von einer hohen Kopienzahl von mRNA von bis zu 1 µg der Gesamt-RNA unterstützt, zu quantifizieren. Reagenzien werden für 50 oder 250 RT-Reaktionen von je 20 µl angeboten.