Thermo Scientific™ ActivX™ Desthiobiotin-ATP Probe

Beschreibung

Thermo Scientific™ Pierce Kinase-Anreicherungskits verwenden ActivX™ ATP- oder ADP-Sonden zur kovalenten Markierung des aktiven Zentrums von ATPasen, einschließlich Chaperonen und metabolischen Enzymen, um ihre selektive Anreicherung mit einem Desthiobiotin-Tag zu ermöglichen.

ActivX Desthiobiotin-ATP und -ADP sind Nukleotid-Derivate, die das aktive Zentrum von Enzymen an konservierten Lysin-Resten in der Nukleotid-Bindungsstelle kovalent verändern. Die Struktur dieser Sonden besteht aus einem modifizierten Biotin (Desthiobiotin), das über eine labile Acyl-Phosphat-Bindung an das Nukleotid gebunden ist. Desthiobiotin ist ein Biotin-Analogon, das weniger eng an Biotin-Bindungsproteine bindet, was zu einer Bindung führt, die sich durch Biotin-Verdrängung, niedrigen pH-Wert oder Wärmedenaturierung leicht umkehren lässt.

AActivX Anreicherungs-Sonden für aktive Zentren sind vorteilhaft für die Bestimmung des aktiven Enzymspiegels durch den Einsatz von Analogon-markierten Sonden, um sowohl inaktive als auch aktive Enzyme profilieren zu können. Die ActivX ATP- und ADP-Sonden dienen der kovalenten Kennzeichnung der aktiven Stelle von ATPasen, einschließlich Chaperonen und metabolischen Enzymen, um ihre selektive Anreicherung mit einem Desthiobiotin-Marker zu ermöglichen.

Desthiobiotin-ATP- oder ADP-Sonden können zur selektiven Anreicherung, Identifizierung und Profilierung von Zielenzymklassen oder zur Beurteilung der Spezifität von Enzym-Inhibitoren verwendet werden. Da viele ATPasen und andere Nukleotid-Bindungsproteine Nukleotide oder Inhibitoren auch im enzymatisch inaktiven Zustand binden, ist mit Desthiobiotin-Sonden das Profiling inaktiver und aktiver Enzyme in einer komplexen Probe möglich. Die Vorinkubation von Proben mit niedermolekularen Inhibitoren, die um das aktive Zentrum konkurrieren, ermöglicht die Bestimmung der Bindungsaffinität von Inhibitoren. Mit Nukleotidsonden für das aktive Zentrum können Off-Targets der Inhibitoren identifiziert werden. Mit der selektiven Anreicherung kann man Zielenzymklassen in Proben identifizieren und profilieren oder die Spezifität und Affinität von Enzym-Inhibitoren beurteilen.

Anwendungen der ActivX ATP- und ADP-Sonden:
• Profilieren Sie kleinmolekulare Bindungsaffinitäten und eine Hemmung des aktiven Zentrums auf dosisabhängige Weise
• Identifizieren Sie Dutzende bis Hunderte von Hemmstoffzielen und Off-Targets aus Geweben, Zellen und subzellulären Proteomen
• Anreicherung von Enzymen auf Basis von Funktionen

Die Beurteilung der Kennzeichnung im aktiven Zentrum mit Desthiobioin-Sonden kann entweder mit Western Blot oder mit Massenspektrometrie (MS) erfolgen. Für den Western Blot-Ablauf werden desthiobiotin-markierte Proteine für die SDS-PAGE-Analyse und den anschließenden Nachweis mit spezifischen Antikörpern angereichert. Für den MS-Ablauf werden Desthiobiotin-markierte Proteine reduziert, alkyliert und enzymatisch zu Peptiden verdaut. Nur die Peptide an den mit Desthiobiotin markierten, aktiven Stellen werden für die Analyse mit LC-MS/MS angereichert. Beide Arbeitsabläufe können zur Bestimmung der Bindung von Hemmstoffzielen verwendet werden, aber nur der MS-Arbeitsablauf kann globale Hemmstoffziele und Off-Targets identifizieren. sind.

Für diese Produkte gilt eine eingeschränkte Nutzungslizenz für die Markierung.