Invitrogen™ Click-iT™ Plus OPP Alexa Fluor™ 647 Protein Synthesis Assay Kit

Das Click-iT™ Plus OPP Alexa Fluor™ 647 Proteinsynthese-Assay-Kit bietet eine schnelle, empfindliche und nicht-radioaktive Methode zum Nachweis der Proteinsynthese mittels Fluoreszenzmikroskopie oder High-Content-Bildgebung. In diesem Assay wird O-Propargyl-Puromycin (OPP) effizient in neu übersetzte Proteine in Methionin-haltigen Komplettmedien integriert und mit einem leuchtenden, photostabilen Alexa Fluor™ fluoreszierenden Farbstoff in einer schnellen, hochspezifischen und schonenden Klick-Reaktion markiert.

Zu den Merkmalen dieses Kits zählen:

• Kein Medienwechsel erfordert – Funktioniert in Methionin-haltigen Komplettmedien; kein Entfernen von Zellmedien notwendig
• Multiplex-fähig – Mit der Click-iT™ Plus Technologie werden das Signal vom GFP und die Bindung fluoreszenzkonjugierter Phalloidine beibehalten
• Nicht radioaktiv – Alternative zu herkömmlichen ³⁵S-Methionin-Methoden
• Funktioniert in vivo – Veröffentlichte Ergebnisse zeigen In-vivo-Verwendung zum Nachweis der Translation von Proteinen

Das Kit enthält O-Propargyl-Puromycin (OPP), ein Alkyn-Analogon von Puromycin (auch separat erhältlich), sowie Alexa Fluor™ 647 Picolylazid und alle erforderlichen Reagenzien für die Klick-Reaktion. Das OPP wird kultivierten Zellen zugeführt und während der aktiven Proteinsynthese in Proteine integriert. Die Zugabe von Alexa Fluor™ 647 Picolylazid und den Klick-Reaktionsreagenzien führt zu einer chemoselektiven Ligation oder „Klick“-Reaktion zwischen dem Picolylazid-Farbstoff und dem OPP-Alkyn. Die modifizierten Proteine werden durch eine bildbasierte Analyse nachgewiesen.

Die Klick-Reaktion nutzt bioorthogonale (biologisch einzigartige) Anteile, die proliferierende Zellen fluoreszierend markieren und geringe Hintergründe sowie eine hohe Detektionsempfindlichkeit erzeugen. Aufgrund der schonenden Reaktionsbedingungen eignen sich Click-iT™ Plus Assays zur Erkennung von Proteintranslationsereignissen bei gleichzeitiger Erhaltung der Zellmorphologie, der Bindung von fluoreszierend-markiertem Phalloidin und des Fluoreszenzsignal von GFP.

Im Gegensatz zu ³⁵S-Methionin, das in herkömmlichen Methoden verwendet wird, handelt es sich bei OPP um kein Aminosäure-Analogon. Daher kann es direkt zu Zellen in Komplettmedien hinzugefügt oder zur Bestimmung der Proteinsynthese in vivo verwendet werden.

Das Kit enthält alle Komponenten, die zur Kennzeichnung und Detektion des integrierten OPP in neu übersetzten Proteinen in Proben adhärenter Zellen erforderlich sind. Das Kit enthält ausreichend Reagenzien für die Markierung von 25 Deckgläsern von 18 mm × 18 mm Größe bei Verwendung von 1 ml Reaktionspuffer pro Test.