Invitrogen™ LiveBLAzer™ FRET-B/G Lade-Kit mit CCF2-AM

Hintergrund:
GeneBLAzer™ Zellbasierte Assays verwenden die membrandurchdringenden Esterformen (CCF2-AM und CCF4-AM) der negativ geladenen fluoreszierenden Beta-Lactamase-Substrate CCF2 und CCF4. Diese lipophilen Ester gelangen schnell in die Zelle, wo sie durch die Spaltung endogenetischer zytoplasmatischer Esterasen schnell in ihre negativ geladenen Formen umgewandelt und im Zytosol eingeschlossen werden.

Der Nachweis mit GeneBLAzer™ Assays basiert auf FRET. Jedes Substrat wird mit zwei Fluorophoren markiert, die ein effizientes FRET-Paar bilden. Ohne Beta-Lactamase-Aktivität führt die Anregung des Cumarins bei 409 nm im intakten CCF2-Molekül im FRET zum Fluorescein, das bei 518 nm ein grünes Fluoreszenzsignal aussendet (Abbildung 1). Bei der Beta-Laktamase-Aktivität trennt die Spaltung von CCF2 die beiden Farbstoffe räumlich und unterbricht die FRET, so dass die Anregung des Kumarins bei 409 nm nun ein blaues Fluoreszenzsignal mit 447 nm erzeugt. Dieses blaue Signal kann leicht unter einem Mikroskop beobachtet werden und kann auch als Erhöhung der Werte im blauen Kanal auf fluoreszierenden Mikrotiterplatten-Lesegeräten erkannt werden.

Die CCF2-AM- und CCF4-AM-Substrate sind wesentliche Assay-Komponenten für die GeneBLAzer™ Plattform. Diese Substrate sind vollständig kompatibel mit der Durchflusszytometrie, wodurch die Zeit bis zur Klonauswahl verkürzt wird. Die ratiometrische Analyse der blauen und grünen Signale reduziert die Variation von Well zu Well aufgrund von Unterschieden bei Zellzahlen und Substratbeladung, was zu hohen Z´-Faktor-Werten und niedrigen Variationskoeffizienten (VK) führt.

CCF2-AM und CCF4-AM unterscheiden sich durch zwei Kohlenstoffe in der Brücke, die den Cumarin-Anteil mit dem Lactam-Ring verbindet. Beide sind membrandurchdringend, verestert und können für Assays in intakten Zellen verwendet werden. CCF4-AM hat bessere Löslichkeitseigenschaften (>24 Stunden löslich) als CCF2-AM und eignet sich daher am besten für Screening-Anwendungen. Darüber hinaus hat CCF4-AM ein etwas besseres FRET und damit einen etwas geringeren Hintergrund als CCF2-AM.

CCF2-FA ist im Wesentlichen das CCF2-Substrat ohne die in der AM-Version gefundenen Ester. CCF2-FA wird entestert und in Zelllysat-Anwendungen verwendet, wobei das Beladen durch die Zellmembran und die Entesterungsschritte umgangen werden. Zelllysate sind die bevorzugte Methode für Anwendungen mit Zellen, die eine Zellwand enthalten. CCF2-FA kann auch als Steuerung zur Erfassung der Anregungs- und Emissionsspektren für CCF2-AM und CCF4-AM verwendet werden.