Invitrogen™ Flp-In™ T-REx™ Core Kit

• Sobald die Flp-InT-REx-Wirtszelllinie mit integrierter FRT-Stelle erstellt wurde, läuft die nachfolgende Herstellung von Flp-InT-REx-Zelllinien, die Gen(e) von Interesse exprimieren, schnell und effizient
• Ermöglicht die Erzeugung isogener, induzierbarer stabiler Zelllinien
• Ermöglicht die polyklonale Selektion stabiler Expressionszelllinien
• Um eine Flp-InT-REx-Wirtszelllinie für die Genexpression zu erzeugen, wird zunächst die Säugetier-Zelllinie sequentiell mit pFRT/lacZeo und pcDNA6/TR transferiert, die beide nach dem Zufallsprinzip und unabhängig voneinander in das Wirtsgenom integriert werden
• Erstere enthält eine FRT-Stelle (für homologe intermolekulare Rekombination), die unmittelbar hinter dem Initiationscodon der lacZ-Zeocin-Fusion liegt
• Letztere exprimiert konstitutiv den Tetracyclin-Repressor, der eine Regulierung der Aktivität des TetO-₂-Promoters ermöglicht.
• Der nächste Schritt bei der Erzeugung einer induzierbaren Zelllinie besteht darin, des pOG44- und pcDNA5/FRT/TO-Vektors, von denen letzterer das Gen enthält, das unter Kontrolle des Tetracyclin-regulierten CMV/TETO₂-Promotors liegt, in die Wirtszelllinie zu transferieren.
• Eine homologe Rekombination zwischen FRT-Stellen in pcDNA5/FRT/TO und auf dem Wirtszellenchromosom, die durch die aus pOG44 exprimierte Flp-Rekombinase als Katalysator Zelllinienderivate erzeugt, in denen das Gen stabil in das Wirtszellenchromosom integriert wird
• Diese Zellen können mithilfe einer durch Rekombination erworbenen Hygromycin- und Blasticin-Resistenz selektiert und erhalten werden

Expression bei Säugetieren, Proteinexpression, Proteine, Expression, Isolierung und Analyse, regulierte Expression, zielgerichtete Integration