Invitrogen™ BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression Vector Kit

Der im BLOCK-iT Pol II miR RNAi-Expressionsvektorkit enthaltene pcDNA™6.2-GW/miR Vektor dient zum Exprimieren künstlicher miRNAs, die mit 100 % Homologie für Ihre Zielsequenz konzipiert wurden und eine Zielspaltung zur Folge haben. Dieser Vektor enthält Seiten- und Schleifensequenzen aus einer endogenen miRNA, die die Exzision der manipulierten miRNA aus einem längeren Pol II Transkript (pre-miRNA) leitet. Mit dem preisgekrönten Invitrogen BLOCK-iT RNAi-Designer erzeugen über 70 % der Konstrukte einen Knockdown von mehr als 70 %. Die Pol II Expression der manipulierten miRNAs sorgt für:

• Starke Expression aus dem CMV Immediate-Early Promotor, mit der Möglichkeit zur Verwendung gewebespezifischer bzw. anderer regulierter Promotoren über MultiSite Gateway™ Rekombination
• Kompatibilität mit vielen Invitrogen Gateway Zielvektoren (DEST-Vektoren) für die Genexpression, einschließlich lentiviraler Vektoren für die stabile Transduktion von sich teilenden, sich nicht teilenden und primären Zelltypen, dem Flp-In™ System für die chromosomale Integration an einer einzelnen Stelle und alternativen Reportergen-Fusionskonstrukten
• Expression von mehr als einer manipulierten miRNA auf demselben Transkript, was einen simultanen Knockdown mehrerer Gene und die Erzeugung synthetischer Phänotypen ermöglicht

Funktionsweise
Für hohe Expression Ihrer miR RNAi-Sequenz enthält der pcDNA6.2-GW/miR Vektor den CMV-Promotor. Sie müssen lediglich eine RefSeq-Zugangsnummer oder eine Nukleotid-Sequenz in den kostenlosen Online-RNAi-Designer BLOCK-iT eingeben und die Software erzeugt optimierte miRNAs als 100%ige Homologa des angestrebten Ziels. Klonierung von miRNA in den Vektor mithilfe eines schnellen Ligationsprotokolls und Transfektion für eine sofortige miRNA-Expression. Die exprimierte miRNA wird von der endogenen Zellmaschinerie im Zellkern verarbeitet (einschließlich Drosha) und anschließend in das Zytoplasma transportiert, wo sie von Dicer weiterverarbeitet wird. Die vollständig verarbeitete miRNA wird dann in RISC integriert, wo sie wie eine siRNA funktioniert und zu einer Spaltung der Ziel-mRNA führt.
Für eine Vielzahl an Expressionsoptionen lassen sich miRNA-Kassette, miR flankierende Bereiche und eine dem interessierenden Target homologe miRNA, leicht in eine Vielzahl von DEST-Vektoren verschieben. Dies geschieht durch Gateway Rekombinationsreaktionen, bei denen die miRNA-Kassette in einen pDONR™ Vektor (BP-Reaktion) und dann in einen DEST-Vektor (LR-Reaktion) Ihrer Wahl übertragen wird.

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