Invitrogen™ GeneArt™ High-Order Genetic Assembly Systems, with yeast growth media

Das GeneArt™ High-Order Gen-Assemblierungssystem ist ein hocheffizientes Kit für die gleichzeitige und nahtlose Zusammenstellung in jeden Vektor von bis zu 10 DNA-Fragmenten, die sich auf eine Länge von bis zu 110 kbp summieren. Das System beruht auf der Fähigkeit der Hefe, DNA-Fragmente mit hoher Effizienz aufzunehmen und zu rekombinieren. Dadurch wird die In-vitro-Behandlung von DNA erheblich reduziert, und es sind keine enzymatischen Behandlungen wie Restriktionen und Ligationen mehr erforderlich, während gleichzeitig präzise Fusionen von DNA-Sequenzen möglich sind. Das Kit enthält Materialien für die Umwandlung und Reinigung von Hefe (erhältlich mit oder ohne Hefeselektivmedien) und kompetentem E. coli für die Plasmid-Amplifikation brauchbarer Klone.

• Einfach und leistungsstark — Klonen von bis zu 10 DNA-Fragmenten, mit der Sequenz Ihrer Wahl, simultan in einem einzigen Vektor (bis zu 110 kb); keine Stellen für Restriktionsverdau, Ligation oder Rekombination erforderlich
• Präzision und Effizienz — So konzipiert, dass beliebige Klonierungen vorgenommen werden können, sodass bis zu 90 % der korrekten Klone erzielt werden, ohne zusätzliche Sequenzen auszulassen
• Flexibilität —Verwenden Sie unseren linearen Vektor, einen Vektor Ihrer Wahl, oder klonen Sie bereits vorhandene DNA-Fragmente, die ohne weitere Modifikationen keine Endhomologie aufweisen
• Kostenlose Tools — Entwerfen Sie DNA-Oligos und mehr mit unserer kostenlosen webbasierten Oberfläche, die Sie Schritt für Schritt durch Ihr Projekt führt
• Vielfältige Anwendung — Optimieren Sie synthetische und molekulare Biologietechniken durch rasche Kombination, Addition, Löschung oder Austausch von DNA-Segmenten

Für das Klonen von 1 bis 4 DNA-Fragmenten begrenzter Größe. Wenn Sie einen In-vitro-Ansatz bevorzugen, sollten Sie das GeneArt™ Kit für die nahtlose Klonierung und Assemblierung (Kat.-Nr. A13288) in Betracht ziehen.

Einfache Erstellung neuer spezifischer Konstruktionen aus verschiedenen DNA-Fragmenten
Das GeneArt™ High-Order Genetic Assembly System nutzt die transformationsassoziierte Rekombination (TAR) in der Hefe Saccharomyces cerevisae, um bereits vorhandene DNA-Fragmente oder chemisch synthetisierte Oligonukleotide zu einem einzigen rekombinanten Molekül zu verbinden. DNA-Fragmente und der linearisierte Vektor werden basierend auf gemeinsamer endterminaler Homologie verbunden. Wenn zwischen den Stücken keine solche Endhomologie existiert, können sie mit Rekombinationslinkern, synthetischen DNA-Oligonukleotiden, zusammengefügt werden, die eine endterminale Homologie zwischen zwei nicht verwandten DNA-Fragmenten liefern. Der Prozess ist sehr effizient und nahtlos und hinterlässt nach der Zusammenstellung keine zusätzlichen Sequenzen. Obwohl es erwiesenermaßen für bis zu 0,5 Mb und 50 DNA-Fragmente funktioniert, wurde dieses Produkt für bis zu 110 kb und 10 DNA-Fragmente in einem Vektor optimiert.

Einfache Klonverifizierung
Um die Arbeit mit Hefe zu minimieren, werden rekombinante Hefeklone einem vereinfachten 10-minütigen DNA-Extraktionsprotokoll unterzogen. Der Extraktionsschritt liefert das zusammengesetzte Molekül in ausreichender Menge, um die Kolonie-PCR-Verifizierung der Verbindungen durchzuführen, sowie die direkte Transformation von E.coli-Zellen für die nachfolgende Analyse. Der firmeneigene Lysepuffer und Glasperlen, die für die Extraktion benötigt werden, sind im Kit enthalten. Zur Auswahl rekombinanter Hefeklone bieten wir ein selektives Hefemedien-Kit, CSM Media für die Hefezellen Mav203 (Kat.-Nr. A13292) an.

Überlegungen für die Auswahl eines Klonvektors
Das GeneArt™ High-Order Genetic Assembly System benötigt Shuttle-Vektoren mit hoher Kapazität, die mit Hefe und E.coli (d. h. BAC-YAC Shuttle-Vektoren) kompatibel sind. Dieses Produkt enthält keinen Klonierungsvektor, aber wir bieten einen gebrauchsfertigen linearen Klonierungsvektor, der als separates Produkt GeneArt™ pYES1L Vector mit Sapphire Technology™ (Kat.-Nr. AA13287) genannt wird. Sie können auch Ihren eigenen Vektor verwenden, aber er muss mit dem High-Order Gen-Assemblierungssystem kompatibel sein. Diese Kompatibilität lässt sich mit unserer GeneArt™ High-Order Vektorkonvertierungskassette (Kat.-Nr.A13291) problemlos erreichen.

Klonierungseffizienz
Bei der GeneArt™ High-Order-Assemblierung sind die Größe der DNA-Elemente, die Anzahl der Elemente ohne Endhomologie, die Gesamtgröße des Endmoleküls sowie die Qualität und Spezifität des Fragments die Hauptfaktoren, die die Klonierungseffizienz beeinflussen. Das terminale Ende der PCR-Fragmente (A-Überhänge oder Stumpf) hat keinen Einfluss auf die Klonierungseffizienz.

Typische Klonierungswirkungsgrade für unterschiedliche Fragmentmengen mit Endhomologie, die mit der Sapphire Technology™ in den GeneArt™ pYES1L Vector integriert werden, sind:

• >90 % für 5 DNA-Fragmente von je 10 kb
• >90 % für 10 DNA-Fragmente von je 5 kb
• >50% für 10 DNA-Fragmente von je 10 kb

Gängige Klonierungseffizienzen für bereits vorhandene Fragmente, ohne Endhomologie, die mit der Sapphire Technology™ unter Verwendung von zusammenfügbaren’ DNA-Oligonukleotiden in GeneArt™ pYES1L Vector integriert werden, sind:

• >90 % für 1 Fragment von je 10 kb
• > 75 % für 2 DNA-Fragmente von je 10 kb

Erstellung von in silico-Klonierungen
Ein wichtiger Schritt in der GeneArt™ High-Order Genetic Assemblierung ist das richtige Design von Fragmenten und Oligos mit der entsprechenden Homologie und den Abständen, die eine erfolgreiche Assemblierung Ihres Klons sicherstellen. Zur Vereinfachung und Beschleunigung des Designprozesses bieten wir ein kostenloses Online-Design-Tool als Hilfsmittel bei der Planung Ihres In-silico-Experiments. Das Tool prüft die Kompatibilität des experimentellen Designs mit den Produktspezifikationen, entwirft DNA-Oligos für die PCR-Amplifikation oder für das Zusammenfügen der verschiedenen zu klonenden Elemente. Außerdem präsentiert es dem Benutzer eine grafische Darstellung des Vektors sowie eine herunterladbare kommentierte Sequenz im GenBank Format, die mit der Vector NTI™ Software kompatibel ist.

Anwendungen
Das GeneArt™ High-Order Genetic Assembly System wurde entwickelt, um Klonierungs- und DNA-Assemblierungsexperimente in zahlreichen Anwendungen in der Molekularbiologie und synthetischen Biologie zu ermöglichen. Das Produkt ermöglicht die Erstellung von modularen Expressionsvektoren mit austauschbaren Teilen und kann für die Ausführung einer Vielzahl verschiedener Aufgaben verwendet werden, die sonst mehrere Schritte umfassen. Das Kit eignet sich für die problemlose Bildung von Fusionsproteinen, die Entfernung, den Austausch oder das Hinzufügen von DNA-Elementen wie Restriktionsstellen, die Klonierung großer bereits vorhandener DNA-Fragmente ohne Endhomologie sowie für viele andere Techniken, die eine Manipulation der genetischen Sequenzen erfordern.

Nur für Forschungszwecke. Darf nicht für diagnostische Verfahren eingesetzt werden.