Invitrogen™ Bac-to-Bac™ HBM TOPO™ Cloning Kit

Bac-to-Bac™ Baculovirus-Expression ist eine effiziente Methode zur Herstellung von Baculoviren für die Expression von Proteinen in Insektenzellen auf hohem Niveau. Sie beruht auf der Erzeugung rekombinanter Viren durch stellenspezifische Transposition in E. coli (DH10Bac™) und nicht auf homologer Rekombination in Insektenzellen. Der neue pFastBac™ HBM TOPO™ Vektor ermöglicht die sezernierte Proteinexpression, da er über das Sekretionssignal von Honigbienen-Melittin (HBM) verfügt. Der neue Vektor sollte ernsthaft für die Expression von Glykoproteinen in Betracht gezogen werden. Glykoproteine können nicht glykosyliert werden, wenn kein Sekretionssignal vorhanden ist. Im Gegensatz zu Glykoproteinen, die aus Säugetierzellen sezerniert werden, können Glykoproteine, die aus Baculovirus sezerniert werden, in vitro leicht entglykosyliert werden. Dies ist ein sehr wichtiges Merkmal, um Proteine zu kristallisieren!

Der Vektor pFastBac™ HBM TOPO™ hat auch einen C-terminalen His-Tag mit einem TEV-Spaltungssignal, um eine einfache Reinigung von Histidin-Fusionsproteinen auf Nickel-Chelatharzen (ProBond™ Aufreinigungssystem) und von nativen Proteinen mit Hilfe der AcTev™ Protease zu ermöglichen.
Der Vektor verwendet den starken Polyhedrin-Promotor, um in einer Vielzahl von Insektenzelllinien wie Sf9, Mimic™ Sf9, Sf21 und High Five™ Zellen in Sf-900 II und Sf-900™ III Medien von Gibco hohe Expressionswerte zu erzeugen.

Herkömmliche Baculovirus-Systeme erfordern die Aufreinigung und Amplifikation eines viralen Überstands mit anfänglich niedrigem Titer. Dies erfordert einen zeitaufwändigen Plaque-Assay. Der Vektor Bac-to-Bac™ pFastBac™ rekombiniert jedoch mit dem übergeordneten Bacmid in kompetenten Zellen von DH10Bac™ E. coli zu einem Expressions-Bacmid. Für die schnelle Produktion eines hohen Titers von reinen, rekombinanten Baculovirus-Partikeln in der ersten Transfektion das Bacmid in Insektenzellen transfizieren. Sie sparen Wochen kostbarer Zeit. Gewinnen Sie einen reinen P2-Baculovirus-Bestand an Tag 10, ohne dass ein mühsamer Plaque-Assay erforderlich ist.