Thermo Scientific™ ActivX™ Desthiobiotin-FP Serine Hydrolase Probe

Beschreibung

Thermo Scientific™ ActivX Fluorophosphonat (FP)-Sonden ermöglichen die kovalente Markierung des aktiven Zentrums von Serinhydrolasen mit Affinitäts-, Fluoreszenz- oder reaktiven Tags und erleichtern dadurch die selektive Anreicherung, den Nachweis oder die Multiplex-Markierung.

ActivX™ FP-Sonden verfügen über eine reaktive Fluorophosphonatgruppe, die spezifisch und kovalent das Serin im aktiven Zentrum von enzymatisch aktiven Serinhydrolasen markiert. Diese Sonden sind mit einem Desthiobiotin-Tag (Biotinanalogon) zur selektiven Anreicherung oder reaktiven Azidogruppe (Staudinger-Reagenzien) erhältlich, die die Multiplex-Markierung bei Verwendung mit Phosphin- oder Alkin-derivatisierten Tags erleichtern.

ActivX Anreicherungs-Sonden für aktive Zentren sind vorteilhaft für die Bestimmung des aktiven Enzymspiegels durch den Einsatz von Analogon-markierten Sonden, um sowohl inaktive als auch aktive Enzyme profilieren zu können. Die ActivX Sonden reichern selektiv nur jene Enzyme an, die zum Zeitpunkt der Markierung funktionell aktiv und biologisch relevant sind. Mit der selektiven Anreicherung kann man Zielenzymklassen in Proben identifizieren und profilieren oder die Spezifität und Affinität von Enzym-Inhibitoren beurteilen.

Anwendungen der ActivX FP-Sonden:
• Bestimmung der Enzymaktivität von Serinhydrolasen in Zellen und Lysaten
• Mapping der Serine im aktiven Zentrum funktionell unterschiedlicher Serinhydrolase-Familienmitglieder (z. B. Proteasen, Lipasen, Esterasen)
• Screening auf Bindungsaffinitäten kleiner Moleküle und Hemmung des aktiven Zentrums
• Profiling von Serinhydrolasen mittels Fluoreszenz, Western Blotting oder Massenspektrometrie

Die Serinhydrolase-Superfamilie ist eine der größten, vielfältigsten Enzymfamilien in eukaryotischen Proteomen. Serinhydrolasen werden im Allgemeinen in zwei große Familien eingeteilt: Serinproteasen (z. B. Trypsin, Elastase und Thrombin) und metabolische Serinhydrolasen. Metabolische Serinhydrolasen werden auf Grundlage von Struktur, katalytischem Mechanismus und Substratpräferenz in mehrere Enzymunterklassen (z. B. Esterasen, Lipasen, Amidasen und Peptidasen) unterteilt. Diese Sonden eignen sich zur Beurteilung der Aktivität oder zum Screening von niedermolekularen Inhibitoren gegen Enzyme, die aus Zelllysaten, subzellulären Fraktionen, Geweben und rekombinanten Proteinen gewonnen wurden.

Die Beurteilung der Kennzeichnung im aktiven Zentrum mit Desthiobioin-Sonden kann entweder mit Western Blot oder mit Massenspektrometrie (MS) erfolgen. Für den Western Blot-Ablauf werden desthiobiotin-markierte Proteine für die SDS-PAGE-Analyse und den anschließenden Nachweis mit spezifischen Antikörpern angereichert. Für den MS-Ablauf werden Desthiobiotin-markierte Proteine reduziert, alkyliert und enzymatisch zu Peptiden verdaut. Nur die Peptide an den mit Desthiobiotin markierten, aktiven Stellen werden für die Analyse mit LC-MS/MS angereichert. Beide Arbeitsabläufe können zur Bestimmung der Bindung von Hemmstoffzielen verwendet werden, aber nur der MS-Arbeitsablauf kann globale Hemmstoffziele und Off-Targets identifizieren. Die Azido-FP-Sonde kann in Kombination mit einem Phosphin- oder Alkin-derivatisierten Tag zum Nachweis oder zur Anreicherung von Serinhydrolasen mit Western Blot oder Massenspektrometrie verwendet werden.

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