Erfolgreiche Gentherapieanwendungen, wenn die Reproduzierbarkeit von Experimenten entscheidend ist
Einführung
Gentherapien sind ein vielversprechendes Mittel, um der Welt in den kommenden Jahren transformative Technologien zur Verfügung zu stellen. Diese gezielten, komplexen Therapien, bei denen in der Regel Vektoren mit Genen in den Patienten eingebracht werden, haben das Potenzial, seltene und schwer zu behandelnde Krankheiten in einer Reihe von medizinischen Bereichen zu heilen. Bevor die Gentherapie ihr Versprechen einlösen kann, müssen jedoch noch einige Herausforderungen bewältigt werden. Eines der wichtigsten Probleme ist die Reproduzierbarkeit der Experimente in der Forschungs- und Entdeckungsphase, die in der Regel in einem akademischen Umfeld stattfindet. Trotz der großen Bedeutung der Reproduzierbarkeit ist es nicht ungewöhnlich, dass Wissenschaftler versuchen, die Ergebnisse eines anderen zu reproduzieren, und dabei scheitern.
"Der Erfolg der Gentherapie hängt von der Entwicklung reproduzierbarer Daten ab."
Es gibt unzählige wissenschaftliche Ansätze und komplexe technische Verfahren, so dass es schwierig sein kann, ein Versuchsergebnis zu reproduzieren. Alle an der Entwicklung und Bereitstellung von Arzneimitteln der nächsten Generation beteiligten Parteien müssen sich auf solide, datengestützte Nachweise ihres Nutzens verlassen können, um die Entscheidungsfindung zu unterstützen und die Umsetzung von vielversprechenden Entdeckungen in wirksame Therapeutika zu gewährleisten.
Hier heben wir einige Hindernisse für die experimentelle Reproduzierbarkeit hervor, die mit der Laborausstattung zusammenhängen, und geben Empfehlungen, wie sie überwunden werden können. Es ist ein absolutes Muss, ein Höchstmaß an Einheitlichkeit bei den gängigen Laborpraktiken zu erreichen. Das bedeutet, dass die Wissenschaftler im Labor ausreichend geschult sein und sich strikt an die korrekten Verfahren für den Betrieb und die Wartung der Laborgeräte halten sollten. In der akademischen Forschung werden diese Protokolle von den Laborleitern auf der Grundlage der Empfehlungen in den Benutzerhandbüchern der Gerätehersteller erstellt. Da es keine spezifischen Regeln gibt, die zu befolgen sind, können die akademischen Praktiken stark variieren. Thermo Fisher Scientific™ hat erkannt, dass es notwendig ist, zusätzliche Unterstützung in Form einer Vielzahl umfassender Materialien, einschließlich technischer, anwendungsbezogener und intelligenter Hinweise, bereitzustellen, um jeden Aspekt der Gerätenutzung und -wartung abzudecken. Alles mit dem Ziel, Ihnen zu ermöglichen, das Beste aus Ihren Geräten herauszuholen und die Reproduzierbarkeit Ihrer experimentellen Daten zu erhöhen.
Verbesserung der Laborpraktiken im Forschungsmaßstab
Plasmidherstellung
In einem akademischen Umfeld werden plasmidkodierende virale Vektoren in der Regel in Escherichia coli-Bakterienzellen auf Orbitalschüttlern wie dem Thermo Scientific™ MaxQ 8000 Stackable Shaker hergestellt. Wenn es darum geht, Plasmid in hoher Qualität, Menge und Reproduzierbarkeit zu erhalten, müssen einige wichtige Merkmale berücksichtigt werden. Es hat sich beispielsweise gezeigt, dass Schütteldrehzahlen von bis zu 400 U/min zu höheren Ausbeuten führen, und die Begrenzung der Zirkulation von Mikroorganismen, die die Kultur potenziell kontaminieren könnten, ist wichtig, um die Integrität des Endprodukts zu gewährleisten. Ebenso stellen Merkmale, die eine regelmäßige, einfache Reinigung ermöglichen, sicher, dass die Oberflächen keine Rückstände von Verunreinigungen aufweisen. Darüber hinaus ist es für die Qualitätskontrolle von Vorteil, wenn die Parameter während des Betriebs des Schüttlers gleichzeitig angezeigt und geändert werden können. Ein intelligenter Hinweis1 zu wichtigen Überlegungen bei der Bewertung eines großen Orbitalschüttlers für die Produktion von Plasmid-DNA ist verfügbar.
Suspensionen müssen je nach Kulturgefäß und Zelltyp mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und Umlaufbahnen geschüttelt werden, daher ist die Wahl des richtigen Orbitalschüttlers für Ihre Anwendung von entscheidender Bedeutung.2 Andere Elemente wie die korrekte Installation des Schüttlers, der Betrieb und die bewährten Verfahren für die Zellproduktion, die Reinigungs- und Desinfektionsverfahren und die regelmäßige vorbeugende Wartung sind ebenfalls von entscheidender Bedeutung für die Verbesserung der experimentellen Reproduzierbarkeit. 3 Thermo Fisher Scientific™ ist immer einen Schritt voraus und hat viel Zeit und Ressourcen investiert, um die am häufigsten benötigten Protokolle zu optimieren (z. B. Plasmid-DNA-Produktion in E. coli4), damit Sie das nicht tun müssen. Sie können die Effizienz steigern und gleichzeitig die experimentelle Reproduzierbarkeit erhöhen, indem Sie diese Protokolle in Ihrem Labor testen und möglicherweise implementieren.
Weitere kritische Aktivitäten bei der Vorbereitung von Plasmid-DNA sind das Pelletieren von Bakterienzellen sowie die Extraktion und Reinigung von Plasmiden. Im akademischen Umfeld ist die Zentrifugation immer noch die beliebteste und kostengünstigste Methode zur Durchführung dieser Schritte. Plasmid-DNA kann beispielsweise in einem Cäsiumchlorid-Gradienten isoliert werden, aber diese Methode erfordert eine Ultrazentrifuge wie die Thermo Scientific™ Sorvall™ WX+ und verwendet Ethidiumbromid. Alternativ können Schwerkraft- oder Spinsäulen-Kits die Plasmid-DNA in Super- und Mikrozentrifugen effektiv reinigen. Um die Reproduzierbarkeit Ihres Protokolls zu erhöhen, können eine Thermo Scientific™ Sorvall™ LYNX 6000 Superspeed Centrifuge und Thermo Scientific™ Fiberlite Carbon Fiber Rotors in Verbindung mit handelsüblichen DNA-Präparationskits verwendet werden, um qualitativ hochwertige Plasmid-DNA in großem Maßstab (etwa 1 mg) zu gewinnen. Alternativ gibt es auch eine kostengünstigere Methode ohne Kit. Beide Protokolle wurden optimiert, und die Empfehlungen sind in Form von Anwendungshinweisen leicht zugänglich.5 Darüber hinaus bietet Thermo Fisher Scientific für alle Zentrifugenmodelle, z. B. für die LYNX,6 umfassende Benutzerhandbücher an, die Desinfektions-, Dekontaminations-, Autoklavier- und Wartungsempfehlungen enthalten, die sich mühelos in Schritt-für-Schritt-Betriebsverfahren umsetzen lassen. So können Sie nicht nur die Lebensdauer einer Zentrifuge verlängern, sondern auch die Erfolgsquote und Reproduzierbarkeit Ihrer Plasmidextraktionsverfahren erhöhen. Wenn Sie darüber hinaus planen, den Forschungsbetrieb in Zukunft in eine GLP/GMP-regulierte Umgebung zu verlagern, kann die Thermo Scientific™ Centri-Log™ Plus Data Management Software7 in Sorvall™ LYNX Zentrifugen integriert werden, um eine genaue Datenerfassung und Rückverfolgbarkeit in Übereinstimmung mit den 21 CFR Part 11 Regeln für elektronische Datenaufzeichnung zu ermöglichen.
Virale Vektorproduktion
Die Entwicklung und Optimierung Ihrer lentiviralen Produktionsplattform zur Erstellung robuster Transfektionsprotokolle kann sehr schwierig sein, insbesondere wenn hohe Ausbeute, Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit Ihre Prioritäten sind. Alle Komponenten, einschließlich der Medien, Transfektionsreagenzien, Zusatzstoffe und Zellen, müssen perfekt zusammenwirken, um hochwertige und funktionelle lentivirale Partikel zu erzeugen. Forschungsanwendungen, wie die Entwicklung neuer Gentherapien, hängen in hohem Maße von einem qualitativ hochwertigen Zellwachstum ab. Ein anschauliches Beispiel hierfür ist die Verwendung einer Klebe- oder Suspensionskultur für HEK 293-Zellen zur Virusproduktion. Wenn die Zellen nicht unter optimalen Bedingungen gezüchtet werden, werden sowohl die experimentellen Ergebnisse als auch die Reproduzierbarkeit in einer Weise beeinträchtigt, die schwer zu erkennen ist.
Die Qualitätseigenschaften des endgültigen Zellprodukts, der Viruspartikel, können je nach den im CO2-Inkubator aufrechterhaltenen Kulturbedingungen stark variieren. In der Tat kann der reproduzierbare Kultivierungsdurchsatz durch die Implementierung verschiedener Merkmale und Technologien bei der Konstruktion von CO2-Inkubatoren stark beeinflusst werden. Da Zellen auf wechselnde oder unterschiedliche Reize reagieren, ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Bedingungen in der Kulturkammer von oben nach unten und von einer Seite zur anderen einheitlich sind, so dass alle Zellen die gleichen Bedingungen vorfinden. Noch wichtiger ist, dass sich der Inkubator nach dem Öffnen der Tür schnell wieder auf die gewünschten Bedingungen einstellt, so dass die Zellen die maximale Zeit bei ihren idealen Parametern verbringen, was die Verdopplungszeit beschleunigt und zur Qualitätssicherung beiträgt. Ideale Bedingungen für die Zellgesundheit und das Zellwachstum beziehen sich nicht nur auf die Temperatur, sondern auch auf den CO2-Gehalt, den Sauerstoffgehalt und die relative Luftfeuchtigkeit (RH), die alle eine Rolle für die Zellgesundheit spielen. Ein Inkubator, der Gleichmäßigkeit und schnelle Erholung gewährleistet, wie die Thermo Scientific™ Heracell™ VIOS CO2 und Forma™ Steri-Cycle™ CO2 Inkubatoren, wird dazu beitragen, die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge zu erhöhen. Darüber hinaus bietet Thermo Fisher Scientific Best-Practice-Informationen für die ordnungsgemäße Pflege und Wartung Ihres Zellkulturbrutschranks, einschließlich Ratschlägen zur Installation und Positionierung im Labor, zur Verringerung der Kontamination und zu Desinfektionsverfahren sowie Empfehlungen zur Verwendung des richtigen Wassertyps. Alles mit dem Ziel, qualitativ hochwertige Versuchsergebnisse zu gewährleisten, die Ihre Entdeckungen voranbringen.8,9
Wenn Sie Ihre lentiviralen HEK 293-Produktionszellen in Suspension züchten, können Sie von der Verwendung eines CO2-resistenten Orbitalschüttlers mit geringer Stellfläche profitieren. Diese Schüttler sind ideal für den Einsatz in einem CO2-Inkubator und verfügen über speziell behandelte mechanische Komponenten, die bis zu 20 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit standhalten. Im Vergleich dazu sind die meisten Orbitalschüttler im Freien nicht für die sauren Bedingungen in einer CO2-Kammer ausgelegt und müssen regelmäßig ausgetauscht werden. Thermo Scientific™ CO2-resistente Orbitalschüttler sind außerdem so konstruiert, dass sie nur minimale Wärme ableiten, um sicherzustellen, dass die Bedingungen in der CO2-Inkubationskammer nicht beeinträchtigt werden. Die richtige Wahl eines Orbitalschüttlers für Ihre Anwendung kann seine Lebensdauer verlängern und dafür sorgen, dass optimale Wachstumsbedingungen und reproduzierbare Kultivierungsergebnisse erhalten bleiben.
Schlussfolgerungen
Es gibt viele Beispiele für Laborgeräte in der Gentherapieforschung, an die Sie vielleicht nicht denken, die aber einen erheblichen Einfluss auf die Reproduzierbarkeit Ihrer Versuchsergebnisse haben können. Die entscheidende Lektion, die Sie sich merken sollten, ist, dass Sie mehr Aufmerksamkeit und Zeit aufwenden müssen, um sich mit den Empfehlungen der Lieferanten vertraut zu machen, die in den Benutzerhandbüchern und verschiedenen technischen Hinweisen enthalten sind. In experimentellen Forschungsumgebungen ist es üblich, sich hauptsächlich auf spezifische Versuchsprotokolle zu konzentrieren und spezifische Empfehlungen für die Installation und richtige Positionierung der Geräte sowie für die Pflege und vorbeugende Wartung, die Vermeidung von Kontaminationen und die Reinigung und Desinfektion außer Acht zu lassen. Denken Sie daran, dass auch Laborgeräte wie Sicherheitswerkbänke, Zentrifugen, Inkubatoren, Schüttler, Kühl- und Gefrierschränke mit Respekt und viel Sorgfalt behandelt werden müssen. Sie müssen zu einem Partner auf Ihrem Weg werden, Ihre Experimente erfolgreicher und reproduzierbarer zu machen.
Referenzen
1 Thermo Scientific. Smart Note: Orbitalschüttler - Welche Merkmale sind bei der Evaluierung eines großen Orbitalschüttlers für die Produktion von Plasmid-DNA-kodierenden viralen Vektoren für Anwendungen wie CAR-T, Gentherapie oder andere gentechnische Verfahren wichtig? https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LPD/Product-Information/Orbital-Shakers-DNA-Encoding-SmartNote-SNORBSHAKERDNA-EN.pdf
2 Thermo Scientific. Anwendungshinweis: Auswahl des richtigen Orbitalschüttlers für Ihre Anwendung. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D20064.pdf
3 Thermo Scientific. Anwendungshinweis: Orbitalschüttler Benchmarks - Best Practices für Gebrauch und Wartung. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/Orbital-Shaker-Benchmarks-Best-Practices-App-Note-ANMAXQBEST.pdf
4 Thermo Scientific. Anwendungshinweis: Optimierung der Plasmid-DNA-Produktion in Escherichia coli unter Verwendung des Thermo Scientific MaxQ 8000 Incubated Stackable Shakers. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D19993~.pdf
5 Thermo Scientific. Anwendungshinweis: DNA-Präparation mit der Thermo Scientific Sorvall LYNX Superspeed Zentrifugenserie. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D21231.pdf
6 Thermo Scientific. Gebrauchsanweisung: Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000/6000 Hochgeschwindigkeitszentrifuge. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLED%2Fmanuals%2F50136519-h-Thermo%20Scientific%20Sorvall%20LYNX-en.pdf
7 Thermo Scientific. Centri-Log Plus Software: Eine genaue und zuverlässige Datenmanagementlösung. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLPD%2Fbrochures%2FCentriLog-Plus-Brochure-GLOBAL-FNL-FWR-1.pdf
8 Thermo Scientific. Technischer Hinweis: Richtige Pflege und Wartung für einen Zellkultur-Inkubator. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Warranties/TNCO2CAREFEED-EN.pdf
9 Thermo Scientific. Smart Note: CO2 Inkubatoren - Smart Water für Ihren CO2 Inkubator. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/brochures/CO2-Incubator-Water-SmartNote-EN.pdf
