Downstream-Processing (DSP) von primären T-Zellen mit Thermo Scientific™ General-Purpose Pro Zentrifugen
Einführung
Das Waschen und Konzentrieren von Zellen ist einer der wichtigsten Schritte in der Zelltherapieforschung und -herstellung. Bei diesem Schritt werden expandierte Zellkulturen konzentriert und in geeigneten Pufferlösungen gewaschen, um sie für nachgelagerte Schritte, wie Abfüllung und Formulierung, vorzubereiten. Die wichtigste Methode ist seit vielen Jahren die Batch-Zentrifugation, obwohl sich im Laufe der Jahre alternative Methoden wie die Durchflusszentrifugation, die akustische Trennung und die Tangentialflussfiltration herausgebildet haben.
Hier zeigen wir die Vorteile der Batch-Zentrifugation sowie innovative Lösungen mit Thermo Scientific™ General-Purpose Pro Zentrifugen, die für das Downstream-Processing von primären T-Zellen optimiert werden können. Außerdem zeigen wir einige beispielhafte Ergebnisse zur Lebensfähigkeit und Rückgewinnung von T-Zellen nach dem Waschen und Konzentrieren.
Zweckdienliche Ausrüstungsmerkmale für die Herstellung von Zelltherapieanwendungen
Sichere und vollständige Kontrolle: SECURE-Spin
Die Zentrifugen bieten ein fortschrittliches Benutzerverwaltungssystem im SECURE-Spin-Modus, bei dem den Benutzern verschiedene Rollen und Privilegien zugewiesen werden, um eine sichere Kontrolle zu gewährleisten, eine Funktion, die die Einhaltung von FDA 21 CFR Part 11 unterstützt (Abbildung 1). Die fortschrittlichen Funktionen des SECURE-Spin-Modus ermöglichen Ihnen:
- Bis zu 120 Personen mit eindeutigen Benutzernamen und Passwörtern zu registrieren.
- Jedem Benutzer individuelle Privilegien und Rollen mit unterschiedlichen Berechtigungen zuzuweisen.
- Nachverfolgung aller Benutzeränderungen an Programmen oder Einstellungen mit einem Audit Trail.
Reproduzierbarkeit: Die ACE-Integratorfunktion
Die Thermo Scientific™ Accumulated Centrifugal Effect™ (ACE™) Integrator Function ist ein mathematisches Modell, das dabei hilft, Anwendungen und Parametereinstellungen zwischen Zentrifugen zu übertragen, indem es automatisch die Laufdauer als Ersatz für die Zeit modifiziert (Abbildung 2).
Die ACE-Funktion kann aktiviert werden, indem man zu "Einstellungen" und dann zu "Steuerungen" navigiert, bevor man den Sollwertmodus auf "Erweitert" ändert. Sie wurde entwickelt, um sicherzustellen, dass verschiedene Probenchargen denselben gewünschten Zentrifugaleffekt erhalten, unabhängig vom Gewicht der Probe, dem Alter des Geräts oder Umweltfaktoren wie der Höhe (Abbildung 3). Zu den Vorteilen der Funktionsaktivierung für General-Purpose Pro Zentrifugen gehören:
- Ermöglicht die gleiche akkumulierte Zentrifugalkraft unabhängig von den Bedingungen (z. B. Laufzeit, Rotorbelastung und Probengewicht).
- Erzielt reproduzierbare Ergebnisse durch automatischen Ausgleich von Schwankungen der Beschleunigung durch Anpassung der Zentrifugenlaufzeit.
- Unterstützt die wichtige Reproduzierbarkeit in der Zell- und Gentherapie.
Um den ACE-Wert zu ermitteln, wird ein Arbeitsprotokoll benötigt, bei dem Geschwindigkeit und Laufzeit bekannt sind. Geben Sie im ACE-Modus den optimalen Geschwindigkeitswert und einen "hohen" ACE-Wert ein (der höhere Wert soll sicherstellen, dass der Lauf nicht vorzeitig abgebrochen wird). Starten Sie zu Beginn des Zentrifugationslaufs eine Stoppuhr, halten Sie die Zentrifuge an, wenn die Zeit auf der Stoppuhr die bekannte Laufzeit erreicht hat, und notieren Sie den auf dem Bildschirm angezeigten ACE-Wert.
Vermeidung von Kontamination
Thermo Scientific™ ClickSeal™ Biocontainment-Deckel schützen die Proben vor gegenseitiger Kontamination und ermöglichen die Zentrifugation verschiedener Proben im selben Lauf. Im Falle eines Verschüttens wird die Probe in ihrem Becher eingeschlossen und schützt so die Proben in anderen Bechern, die Benutzer und die Laborumgebung. Die wichtigsten Merkmale der ClickSeal-Deckel sind:
- Ergonomisches Design für einfaches Öffnen und Schließen mit nur einer Hand, entweder für Links- oder Rechtshänder.
- Biocontainment-Versiegelungsoptionen für eine handschuhfreundliche Verwendung.
- Einfache Bedienung für alle Labornutzer durch den Wegfall von Drehverschlüssen und komplizierten Hochdruck-Clips.
- Biocontainment-Zertifizierung durch das National Institute for Health Protection, Porton Down, UK.
Der Gesundheitszustand in der Zelltherapie-Forschung und -Herstellung, insbesondere für autologe Zelltypen, ist nicht ohne weiteres verfügbar, und Schnelligkeit ist der Schlüssel zum Erfolg. Daher müssen die Laborgeräte bereit sein, im Bedarfsfall einwandfrei zu funktionieren. Die "Health Status"-Taste auf unseren Zentrifugen verfolgt und protokolliert jeden Alarm, jede Warnmeldung und jeden Rotorlebenszyklus (Abbildung 4). Dies verhindert Ausfallzeiten, die für die Kontinuität der Prozesse unerlässlich sind.
Rotormanagement: SMART-Spin™
Das SMART-Spin™ Advanced Rotor Management System maximiert die Beschleunigung, die Abbremsung und das Ungleichgewicht der Restlast für jede Rotor- und Becheroption. General-Purpose Pro Zentrifugen ermöglichen darüber hinaus die Feinabstimmung der Zentrifugationsparameter mit hoher Präzision (in Schritten von 1rpm für die Geschwindigkeit und 1s für die Zeit). Darüber hinaus tragen sanfte Beschleunigungs- und Abbremsvorgänge dazu bei, die Integrität des Pellets zu maximieren und gleichzeitig die Prozesseffizienz aufrechtzuerhalten. Im folgenden Beispiel haben wir das Beschleunigungsprofil 9 und das Verzögerungsprofil 7 verwendet, um den Zellverlust zu minimieren und die Lebensfähigkeit zu erhalten.
Lebensfähigkeit und Rückgewinnung von T-Zellen
Methoden
Primäre T-Zellen, die von gesunden Spendern zur Verfügung gestellt wurden, wurden in 50mL und 500mL konische Behälter mit einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL transferiert. Die Zellzählung wurde mit dem Via2-Cassette™-Gerät und dem NucleoCounter™ NC-200™-Instrument (ChemoMetec; Allerod, Dänemark) durchgeführt. Die Behälter wurden in der Thermo Scientific™ Multifuge™ X4R Pro General-Purpose Zentrifuge bei 400 x g und Raumtemperatur für 10 Minuten zentrifugiert. Die Lebensfähigkeit und die Wiederfindung der T-Zellen wurden nach dem Waschen und Konzentrieren bestimmt. Hinweis: Die verwendete Zellkonzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml ist vier- bis fünffach niedriger als übliche Werte, um ein Worst-Case-Szenario zu simulieren.
Ergebnisse
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide konischen Behältertypen, 50mL und 500mL, bei der Konzentration von T-Zellen gleichwertig sind, mit einer minimalen Abnahme der Lebensfähigkeit und hohen Rückgewinnungsraten (Abbildung 5).
Schlussfolgerungen
Die Chargenzentrifugation ist seit Jahrzehnten das Arbeitspferd der Zelltherapieherstellung. Auf der Grundlage unserer Ergebnisse kommen wir zu dem Schluss, dass sie aufgrund der folgenden Vorteile die bevorzugte Methode ist:
- Keine Einschränkung bei den verwendbaren Zelltypen.
- Kein Verstopfen, wenn hohe Zelldichten verarbeitet werden.
- Hohe Leistung bei geringer Zelldichte.
- Aktive Kontrolle und Aufrechterhaltung der Prozesstemperatur.
- Niedrige Investitionskosten, mit geringen Wartungs- und Betriebskosten.
- Unkomplizierte Prozessentwicklung.
- Flexibel genug, um für zahlreiche Laboranwendungen eingesetzt zu werden.
